BMP9調(diào)控小鼠根尖牙乳頭干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化及其機(jī)制的初不研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了詳細(xì)闡述。
　　第一部分CD1小鼠原代根尖牙乳頭干細(xì)胞提取、培養(yǎng)、永生化。
　　目的:CD1小鼠根尖牙乳頭干細(xì)胞原代培養(yǎng)及永生化。
　　方法:斷頸處死CD1小鼠，拔出小鼠下頜中切牙，從牙根尖表面輕輕用組織剪離斷根尖牙乳頭，采用Ⅰ型膠原酶消化法，消化分離的根尖牙乳頭組織塊，傳代培養(yǎng)。采用SV40大T抗原逆轉(zhuǎn)錄病毒方法轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞，hygromycin B藥物進(jìn)行篩選，構(gòu)建小鼠永生化根尖牙乳頭干細(xì)胞系

2、。
　　結(jié)果:膠原酶消化根尖牙乳頭組織塊后的原代細(xì)胞，細(xì)胞呈現(xiàn)為梭形、多角形、紡錘形，類似于成纖維細(xì)胞。貼壁生長(zhǎng)后的細(xì)胞平鋪，呈現(xiàn)為多邊形，體積大。hygromycin B藥物篩選后，能生存下來的細(xì)胞說明成功轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)表現(xiàn)為殺死細(xì)胞漂浮，存活細(xì)胞仍然貼壁生長(zhǎng)。MAPs傳代到一定程度后細(xì)胞增殖能力停滯， iMAPs增殖能力伴隨傳代增長(zhǎng)的細(xì)胞慢慢融合，增殖能力持續(xù)。MAPs與iMAPs傳代后倍增能力存在顯著性差異(P＜0.05)。

3、r>　　結(jié)論:Ⅰ型膠原酶消化組織塊法能有效提取、分離和原代培養(yǎng)小鼠根尖牙乳頭干細(xì)胞。采用SV40大T抗原逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞，Hygromycin B藥物篩選法，能成功構(gòu)建永生化的小鼠根尖牙乳頭干細(xì)胞系，是后續(xù)牙組織再生工程研究的前提和基礎(chǔ)。
　　第二部分定量比較MAPs與iMAPs細(xì)胞系增殖率等生物學(xué)特性。
　　目的:定量比較MAPs與iMAPs細(xì)胞系增殖率等生物學(xué)特性。
　　方法:通過結(jié)晶紫染色法、MTT法、胎盤

4、藍(lán)染色法等來檢測(cè)MAPs與iMAPs細(xì)胞之間的差異性。
　　結(jié)果:結(jié)晶紫染色及掃描結(jié)果顯示:iMAPs及MAPs兩者之間的增殖率存在顯著性差異(P＜0.05); MTT法測(cè)量結(jié)果顯示:iMAPs及MAPs兩者之間的增殖率存在顯著性差異(P＜0.05);胎盤藍(lán)染色結(jié)果顯示:iMAPs細(xì)胞的存活率及增值能力均明顯高于MAPs(P＜0.05)。
　　結(jié)論:永生化后的小鼠根尖牙乳頭干細(xì)胞系與原代細(xì)胞系相比，具有更好的存活率及增值率。

5、對(duì)今后的組織工程及再生醫(yī)學(xué)研究具有重要的意義。
　　第三部分免疫熒光法檢測(cè)iMAPs細(xì)胞MSC標(biāo)志物的表達(dá)。
　　目的:通過免疫熒光法檢測(cè)iMAPs細(xì)胞MSC標(biāo)志物的表達(dá)。
　　方法:將iMAPs細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)板中，用10％福爾馬林室溫下固定，用10％ BSA室溫下封閉，在實(shí)驗(yàn)組每孔中加入一抗，對(duì)照組每孔中加入PBS，隨后加入熒光二抗，加入DAPI，熒光倒置顯微鏡下，不同放大倍數(shù)下觀察細(xì)胞并采集圖像。
　　

6、結(jié)果:iMAPs表達(dá)MSC標(biāo)志物，如:BMPRⅡ、CD117(c-kit)、CD29(Integrinβ1)、CD44、CD73、CD90(Thy-1)、CD105(Endoglin)、CD133(Proml)、CD166(ALCAM)。不表達(dá)CD14、CD34及CD45。
　　結(jié)論:永生化后的iMAPs細(xì)胞保持了MSC干細(xì)胞特性。
　　第四部分 BMP9調(diào)控iMAPs及MAPs體外成牙本質(zhì)分化的影響。
　　目的:體外

7、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)BMP9對(duì)iMAPs及MAPs細(xì)胞早期ALP的表達(dá)、晚期OCN及OPN表達(dá)以及基質(zhì)礦化作用;同時(shí)通過RT-PCR檢測(cè)成牙本質(zhì)分化相關(guān)目的基因的表達(dá);從微觀角度闡明其對(duì)iMAPs及MAPs細(xì)胞分化的調(diào)控作用。
　　方法:擴(kuò)增并提取高滴度的Ad-BMP9及Ad-GFP病毒，iMAPs及MAPs分別被病毒感染，成牙本質(zhì)細(xì)胞分化有不同的標(biāo)志物。堿性磷酸酶活性是細(xì)胞成牙本質(zhì)分化的早期表現(xiàn)，晚期階段，茜素紅染色檢測(cè)基質(zhì)的礦化作用

8、，細(xì)胞免疫組化檢測(cè)骨橋蛋白和骨鈣素表達(dá);同時(shí)在不同時(shí)間點(diǎn)收集腺病毒感染iMAPs及MAPs細(xì)胞的RNA，然后轉(zhuǎn)化為cDNA，通過RT-PCR，檢測(cè)成牙本質(zhì)分化等相關(guān)目的基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的腺病毒Ad-GFP及Ad-BMP9感染效率高，iMAPs及MAPs細(xì)胞能被有效感染。(2)逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果:在BMP9刺激iMAPS及MAPs細(xì)胞后，相關(guān)目的基因表達(dá)有明顯的上調(diào)，尤其是與成牙本質(zhì)分化關(guān)系非常密切的基因MEPE

9、、DSPP及DMP1有明顯的上調(diào)。(3) ALP活性、染色及掃描結(jié)果表明，Ad-GFP不能誘導(dǎo)iMAPs及MAPs細(xì)胞ALP活性升高。Ad-BMP9在檢測(cè)的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能顯著促進(jìn)iMAPs及MAPs細(xì)胞ALP活性升高。(4)細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果表明，Ad-GFP感染細(xì)胞后，未檢測(cè)到骨橋蛋白和骨鈣素的表達(dá)。而Ad-BMP9感染細(xì)胞后，能檢測(cè)到骨橋蛋白和骨鈣素的表達(dá)。(5)茜素紅染色結(jié)果表明，Ad-BMP9組中的基質(zhì)礦化作用顯著高于A

10、d-GFP組，Ad-GFP組未見有明顯的基質(zhì)礦化作用。
　　結(jié)論:BMP9在體外能早期促進(jìn)小鼠根尖牙乳頭干細(xì)胞ALP活性增強(qiáng)，晚期OCN、OPN表達(dá)，以及促進(jìn)基質(zhì)的礦化作用。能有效調(diào)控iMAPs及MAPs細(xì)胞成牙本質(zhì)分化，相關(guān)目的基因表達(dá)上調(diào)。
　　第五部分 BMP9調(diào)控iMAPs體內(nèi)成牙本質(zhì)分化的影響。
　　目的:通過體內(nèi)干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)，證實(shí)BMP9信號(hào)能有效促進(jìn)小鼠根尖牙乳頭干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化作用，從宏觀角度闡明其

11、對(duì)iMAPs細(xì)胞成牙本質(zhì)分化的調(diào)控作用。
　　方法:將Ad-GFP、Ad-BMP9感染的iMAPs細(xì)胞注射到無胸腺裸鼠皮下及后腿肌肉內(nèi)。注射4周后，斷頸處死裸鼠，收集移植部位異位形成的組織塊，進(jìn)行微型計(jì)算機(jī)斷層掃描，通過Amira5.3軟件將掃描結(jié)果進(jìn)行三維重建并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。另外，對(duì)異位形成的組織塊常規(guī)石蠟包埋，制備石蠟切片并進(jìn)行組織學(xué)分析:H&E染色、阿辛藍(lán)染色、Masson's Trichrome染色。
　　結(jié)果:(1

12、)干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ad-GFP對(duì)照組不能在無胸腺裸鼠體內(nèi)環(huán)境下形成異位類牙本質(zhì)，而Ad-BMP9實(shí)驗(yàn)組能形成異位類牙本質(zhì)。Micro-CT掃描結(jié)果顯示，Ad-BMP9產(chǎn)生的異位類牙本質(zhì)的平均體積及平均密度均顯著高于Ad-GFP對(duì)照組(P＜0.05)。(2)組織塊H&E染色結(jié)果顯示，BMP9誘導(dǎo)生成的異位類牙本質(zhì)中，能看到部分成熟的細(xì)胞和成束膠原纖維包埋在基質(zhì)中，形態(tài)似帶狀、框架結(jié)構(gòu)等;同時(shí)可觀察到未分化的早期細(xì)胞。也能看到分化后

13、形成的脂肪組織結(jié)構(gòu)。(3) Ad-BMP9感染iMAPs細(xì)胞后，形成的異位類牙本質(zhì)組織中可觀察到骨橋蛋白和骨鈣素的表達(dá)。(4) Ad-BMP9感染iMAPs細(xì)胞后，阿辛藍(lán)染色中發(fā)現(xiàn)有硫酸軟骨素鈣鹽及軟骨基質(zhì)的沉積。這說明BMP9能促進(jìn)小鼠根尖牙乳頭干細(xì)胞的分化，并存在多向分化的潛能，以不同的方式形成類牙本質(zhì)。(5) Masson's Trichrome染色結(jié)果顯示，Ad-BMP9感染iMAPs細(xì)胞后，類牙本質(zhì)組織塊中能看到成熟和礦化的基