不同脂肪酸對INS-1細(xì)胞TXNIP表達(dá)的影響及其機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病的患病率逐年上升，目前已成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，胰島β細(xì)胞凋亡增加是糖尿病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素[1]。近年來有研究表明，2型糖尿病患者體內(nèi)長期高水平的游離脂肪酸(free fatty acids, FFAs)，特別是飽和脂肪酸可以引起胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞功能紊亂，以及β細(xì)胞凋亡的增加，進(jìn)而加重糖尿病[2-4]。
　　硫氧還蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin interacting pro

2、tein, TXNIP)又名VDUP1(Vitamin D(3) up-regulated protein1)和 TBP2(Thioredoxin-binding protein-2)，屬于α抑制蛋白家族，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一內(nèi)源性的硫氧還蛋白(Thioredoxin, Trx)結(jié)合抑制蛋白，在糖尿病各組織中其表達(dá)均顯著升高，已有大量研究證明高糖可引起TXNIP表達(dá)明顯升高，并介導(dǎo)β細(xì)胞功能損傷和凋亡[5-7]。
　　但是，作為糖尿病

3、主要損傷因素之一的游離脂肪酸，其對TXNIP表達(dá)的影響，以及不同飽和程度的游離脂肪酸對TXNIP表達(dá)的可能差別目前尚不清楚。因此本課題旨在研究不同飽和程度的脂肪酸對INS-1胰島細(xì)胞TXNIP表達(dá)的影響，并分析其可能機(jī)制。
　　目的：
　　1.使用不同飽和程度的游離脂肪酸孵育INS-1細(xì)胞，觀察不同類型脂肪酸對INS-1胰島細(xì)胞凋亡及TXNIP表達(dá)的影響。
　　2.分析脂肪酸調(diào)節(jié)TXNIP表達(dá)的可能機(jī)制。
　　方

4、法：
　　1.實驗分組：將正常培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞分為四組：分別是正常對照組(含0.55％fatty acid free-BSA的RPMI1640培養(yǎng)基)、飽和脂肪酸-軟脂酸組(0.5 mmol/L軟脂酸+0.55%fatty acid free-BSA)、單不飽和脂肪酸-棕櫚油酸組(0.5 mmol/L棕櫚油酸+0.55%fatty acid free-BSA)、多不飽和脂肪酸-DHA組(0.5 mmol/L DHA+0.55%

5、fatty acid free-BSA)，均于培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行指標(biāo)測定。
　　2.采用Real-time PCR方法測定FFAs處理后INS-1細(xì)胞TXNIP mRNA表達(dá)量。
　　3.采用Western blot方法檢測FFAs處理后INS-1細(xì)胞TXNIP、Cleaved caspase-3、Caspase-3、ChREBP、FOXO1、p-NF-κB蛋白表達(dá)。
　　4.采用免疫熒光技術(shù)檢測FFAs處理后

6、INS-1細(xì)胞中ChREBP蛋白表達(dá)。
　　5.使用Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測INS-1細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　1.不同飽和程度的FFAs對INS-1細(xì)胞TXNIP表達(dá)的影響不同。
　　與對照組相比，飽和脂肪酸軟脂酸組TXNIP mRNA和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，而不飽和脂肪酸棕櫚油酸組和DHA組INS-1細(xì)胞TXNIP表達(dá)均沒有明顯的改變(見圖1)。
　　如圖2所示，軟脂酸引

7、起的TXNIP的蛋白表達(dá)從18 h開始增加，并于24 h達(dá)到最高。36 h時，軟脂酸誘導(dǎo)的TXNIP表達(dá)降低到原蛋白水平。而棕櫚油酸和DHA在12 h、18 h、24 h、36 h不同的時間點對TXNIP表達(dá)與對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2. FFAs由于其飽和程度的不同對INS-1細(xì)胞凋亡也具有不同的影響。
　　如圖3所示，軟脂酸組Cleaved caspase-3/caspase-3的比值與對照組相比明顯增加。棕櫚油

8、酸組和DHA組Cleaved caspase-3/caspase-3比值與對照組相比無顯著性差異。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，軟脂酸組INS-1細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯增加，而棕櫚油酸組和DHA組對INS-1細(xì)胞凋亡的影響與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(見圖4)。
　　3.軟脂酸對轉(zhuǎn)錄因子ChREBP和FOXO1蛋白表達(dá)的影響。
　　使用Western blot和免疫熒光方法研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比軟脂酸組ChREBP蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，轉(zhuǎn)錄因子

9、FOXO1蛋白表達(dá)降低。(見圖5-6)
　　4.軟脂酸調(diào)節(jié)INS-1細(xì)胞TXNIP蛋白表達(dá)與NF-κB磷酸化相關(guān)。
　　與對照組相比，軟脂酸組p-NF-κB p65蛋白表達(dá)量明顯增加(見圖7)。加入 NF-κB抑制劑PDTC后，與不加抑制劑組相比，軟脂酸孵育后引起的TXNIP mRNA和蛋白水平的上調(diào)受到明顯的抑制(見圖8)。同樣，使用一種多肽類的NF-κB抑制劑SN50也可降低軟脂酸誘導(dǎo)的TXNIP表達(dá)上調(diào)(見圖9)。同時

10、發(fā)現(xiàn)， PDTC能夠顯著降低軟脂酸誘導(dǎo)的ChREBP表達(dá)上調(diào)(見圖10)，而對軟脂酸下調(diào)FOXO1的表達(dá)沒有影響(見圖11)。
　　5. p38 MAPK參與軟脂酸誘導(dǎo)的TXNIP表達(dá)上調(diào)。
　　與不加抑制劑組相比，使用p38 MAPK抑制劑SB203580可顯著抑制軟脂酸處理后引起的INS-1細(xì)胞TXNIP mRNA和蛋白水平的增加(見圖12)。同時， SB203580也可阻斷了軟脂酸誘導(dǎo)的p-NF-κB p65蛋白表達(dá)上

11、調(diào)(見圖13)，以及軟脂酸對轉(zhuǎn)錄因子ChREBP和FOXO1蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用(見圖14,15)。
　　結(jié)論：
　　1.飽和脂肪酸軟脂酸可能通過誘導(dǎo)TXNIP表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)了INS-1胰島細(xì)胞凋亡。而不飽和脂肪酸棕櫚油酸和DHA對TXNIP表達(dá)以及INS-1細(xì)胞凋亡均無顯著作用。
　　2.軟脂酸上調(diào)TXNIP表達(dá)的機(jī)制與p38 MAPK/NF-κB/ChREBP信號通路有關(guān)，F(xiàn)OXO1可能也參與了TXNIP的調(diào)節(jié)。