特丁基對苯二酚對酒精誘導的心肌細胞凋亡的影響及其機制研究.pdf

1、長年飲用過量酒精能夠引起心臟進行性擴大、并發(fā)各種心律失常和心力衰竭，以此為特征的心肌病變被稱為酒精性心肌病(Alcoholic cardiomyopathy，ACM)。在全世界范圍內，酒精性心肌病的患病率都不斷上升，嚴重威害了人類的健康，并導致衛(wèi)生資源的巨大浪費。ACM的發(fā)病機制有多種，氧化應激與細胞凋亡是其中兩個最重要的機制。酒精可以誘導氧化應激，氧化應激又可以誘導細胞凋亡，這些誘導的損傷變化可以引起心肌細胞功能某些方面的改變，因此可

2、以導致心肌細胞功能障礙，最終降低心肌功能，造成酒精性心肌病。因此，研究一種能夠防治酒精誘導的氧化應激損傷和心肌細胞凋亡的低毒且有效的藥物，對改善ACM預后有著非常深遠的意義。
　　特丁基對苯二酚(tertiary butylhydroquinone，tBHQ)又名為特丁基氫醌，是一種安全有效的抗氧化劑，較其它抗氧化劑具有更為確切的抗氧化穩(wěn)定性。在神經(jīng)細胞及其他細胞系的研究中發(fā)現(xiàn)它具有抵抗氧化應激損傷、對抗細胞凋亡的作用，對心血管系

3、統(tǒng)的作用研究還尚未有報道過。此外有研究表明特丁基對苯二酚可以保護顱神經(jīng)嵴細胞對抗酒精誘導的凋亡，在外周組織細胞如肝、腎等，tBHQ也具有保護作用。因此，我們很有理由去研究特丁基對苯二酚是否也能對心血管疾病中的氧化應激損傷和心肌細胞凋亡產(chǎn)生作用。
　　核NF-E2有關因子2(nuclear factorE2-related fator2，Nrf2)是細胞氧化應激中的中樞調控者。在轉錄正常情況下，Nrf2與Keapl（kelch-l

4、ike ECH-associated proteinl）相互結合，Nrf2的活性作用被Keapl所抑制，并錨定在細胞漿中，在激活情況下，Keapl和/或Nrf2的結構發(fā)生變化，導致Nrf2和Keapl的綁定解除，Nrf2脫離了Keapl的束縛，之后轉入了細胞核，在Maf的參與下與抗氧化反應元件(antioxidantresponse element，ARE)序列結合，誘導與抵抗氧化應激有關的酶基因表達。這些抗氧化酶能夠抵抗活性氧(rea

5、ctive oxygen species，ROS)及毒性物質等對細胞進行的侵害。研究還發(fā)現(xiàn)Keapl與凋亡相關蛋白FAC1、PGAM5、SQSTM1和p26均有關，Keapl還可與Bcl-2結合，使Bax表達增多，激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)而誘導細胞凋亡。Nrf2可以控制Keapl的轉錄而拮抗Keapl的作用，提示Nrf2信號通路與細胞凋亡通路之間可能存在某種非常重要的聯(lián)系。由上可見，Nrf2細胞信號通路在保護細

6、胞免受氧化應激損傷，抑制細胞凋亡和促進細胞存活方面有著非常重要的意義。
　　目的:
　　為此本實驗擬采用H9c2心肌細胞，建立酒精誘導心肌細胞凋亡模型。觀察了在離體細胞給予tBHQ治療后是否可以減輕酒精誘導的心肌細胞凋亡，并且分析了tBHQ抗心肌細胞凋亡的可能機制，這種保護作用是否是部分通過激活抗氧化反應通路Nrf2，調節(jié)Bcl-2和Bax的表達而實現(xiàn)的。
　　方法:
　　1.以H9c2心肌細胞作為研究對象，設立

7、正常對照組;酒精組;tBHQ組;tBHQ+酒精組。濃度根據(jù)已有文獻和預實驗確定。
　　2.采用四唑鹽法檢測tBHQ對心肌細胞存活率的影響。
　　3.應用凋亡檢測試劑盒通過流式細胞儀檢測細胞的凋亡。
　　4.采用活性氧檢測試劑盒通過流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測細胞內活性氧(ROS)的水平。
　　5.應用免疫熒光技術觀察Nrf2的核轉位。
　　6.采用western blotting法檢測心肌細胞總-Nrf2、核

8、-Nrf2、SOD、catalase、HO-1、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表達。
　　7.Nrf2 siRNA雙鏈寡核苷酸干擾細胞及相關指標檢測。
　　8.利用(x)±s的表示方法呈現(xiàn)各組實驗數(shù)據(jù)，并將實驗結果數(shù)據(jù)導入專用數(shù)據(jù)分析軟件spss13.0進行科學分析，采用Student' s t-test和單因素方差分析進行統(tǒng)計學比較，p＜0.05作為有統(tǒng)計學意義的標準。
　　結果:
　　1.顯微鏡

9、下觀察細胞形態(tài)接種的心肌細胞24h后，絕大多數(shù)已經(jīng)貼壁良好，多呈梭形，細胞相互連接成網(wǎng);酒精組細胞變形明顯，漂浮細胞較多;tBHQ組細胞貼壁良好，形態(tài)同對照組無明顯異常改變;tBHQ預處理明顯改善了酒精引起的細胞形態(tài)改變。
　　2.細胞存活率酒精以濃度依賴的方式導致細胞的存活率下降，200mmol/L時細胞存活率下降更為明顯。不同濃度tBHQ(0，0.625，1.25，2.5，5，10，20，50 and100μmol/L)處理細

10、胞48h對細胞生存力無明顯影響。tBHQ預處理細胞明顯升高酒精所導致的細胞存活率下降，并呈濃度依賴的方式，從1μmol/L開始有統(tǒng)計學意義，10μmol/L與5μmol/L時比較生存率未明顯增強，故后續(xù)實驗以5μmol/L來研究tBHQ的保護作用。
　　3.細胞凋亡率AnnexinⅤ-FITC/PI檢測心肌細胞凋亡率顯示200mmol/L的酒精可導致心肌細胞凋亡率明顯增加，而tBHQ預處理細胞與酒精組相比明顯降低了細胞凋亡率。

11、r>　　4.ROS含量細胞內ROS的含量可以cDCF的熒光強度表示，結果顯示200mmol/L的酒精可導致細胞內熒光強度明顯增強，而tBHQ預處理細胞與酒精組相比細胞內熒光強度明顯下降。
　　5.免疫熒光分析酒精組明顯抑制了Nrf2的表達及核轉位，而tBHQ預處理組與酒精組相比，明顯促進了Nrf2的表達及核轉位。
　　6.Western blotting分析結果顯示酒精組Bcl-2蛋白表達量較對照組明顯減少，而Bax表達較對

12、照組明顯增加，caspase-3蛋白表達較對照組也明顯增加，差異具有顯著性(p＜0.05)。而tBHQ預處理組提高了Bcl-2的表達，卻降低了Bax還有caspase-3蛋白的表達，與酒精組比較差異均有顯著性。與此相對應，酒精組總-Nrf2、核-Nrf2、SOD、catalase和HO-1蛋白表達量較對照組明顯減少(p＜0.05)。tBHQ預處理組可以明顯增加心肌細胞總-Nff2、核-Nrf2、SOD、catalase和HO-1蛋白表達

13、(P＜0.05)。
　　7.轉染Nrf2 siRNA結果顯示對照組及tBHQ藥物組轉染Nrf2 siRNA后，Nrf2及其下游的HO-1蛋白表達量均明顯降低。tBHQ預處理組可以明顯抑制酒精導致的caspase-3凋亡蛋白的表達，同時也可降低酒精導致的心肌細胞內ROS含量的增加。而給予Nrf2 siRNA特異敲弱Nrf2的表達后，tBHQ預處理組的這種抑制凋亡蛋白表達和降低ROS含量的作用減低。
　　結論:
　　1.酒

14、精對H9c2心肌細胞以濃度依賴的方式導致細胞存活率降低，200mmol/L酒精可明顯造成心肌細胞損傷，明顯降低細胞存活率。
　　2.200mmol/L酒精可明顯增加心肌細胞ROS的產(chǎn)生，明顯增加心肌細胞凋亡發(fā)生。
　　3.200mmol/L酒精明顯抑制了心肌細胞Nrf2表達、Nrf2核轉位和下游SOD、catalase、HO-1的表達，這可能與增加心肌細胞對酒精的敏感性有關。
　　4.tBHQ可能通過清除細胞內過多的R