β3-AR對體外培養(yǎng)鼠心肌細胞肥大的影響及機制研究.pdf

1、目的：
　　體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細胞，用攜帶β3-AR受體基因的慢病毒轉(zhuǎn)染心肌細胞，在此基礎(chǔ)上用去甲腎上腺素（NE）誘導(dǎo)心肌細胞，建立心肌肥厚模型：
　　（1）觀察使用攜帶β3-AR基因的慢病毒轉(zhuǎn)染心肌細胞是否可以有效提高心肌細胞β3-AR的表達；
　?。?）觀察β3-AR對心肌肥厚的影響；
　　（3）探討β3-AR是否通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑影響心肌肥大,為心肌細胞的實驗研究提供更多參考方法，

2、為β3-AR對心肌肥厚的影響的研究提供更多理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心室肌細胞，細胞培養(yǎng)24h后，分別以轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）20、50、80、100轉(zhuǎn)染只攜帶綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）的慢病毒(空病毒)，慢病毒轉(zhuǎn)染心肌細胞72h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞中綠色熒光蛋白GFP表達情況，以確定慢病毒轉(zhuǎn)染心

3、肌細胞的最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)。心肌細胞以最佳MOI值轉(zhuǎn)染攜帶β3-AR基因慢病毒24h后，用去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)誘導(dǎo)心肌細胞48h，建立體外心肌肥厚模型。實驗分4組：
　?。?）空白對照組(Control組)：不轉(zhuǎn)基因，常規(guī)培養(yǎng)細胞;
　?。?）心肌肥厚組（NE組）：不轉(zhuǎn)基因，常規(guī)培養(yǎng)細胞+NE（2μmol/L）處理細胞48h；
　?。?）β3-AR基因轉(zhuǎn)染+NE組(β3-AR組)：以攜帶β3-A

4、R基因的慢病毒轉(zhuǎn)染心肌細胞+NE（2μmol/L）處理細胞48h；
　?。?）空病毒轉(zhuǎn)染+NE組（空病毒組）：用只攜帶GFP基因的慢病毒（空病毒）轉(zhuǎn)染心肌細胞+NE（2μmol/L）處理細胞48h。用免疫熒光法鑒定心肌細胞，倒置熒光顯微鏡觀察病毒轉(zhuǎn)染組綠色熒光蛋白（GFP）表達，免疫印跡法（Western Blot）和qRT-PCR方法檢測β3-AR、絲裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）、細胞外信號調(diào)控激酶（ERK1/2）及

5、原癌基因c-myc、c-fos蛋白水平和RNA水平的表達。
　　結(jié)果：
　?。?）原代心肌細胞鑒定：免疫熒光法鑒定心肌細胞，分離培養(yǎng)的心肌細胞純度可達95％以上；
　?。?）慢病毒轉(zhuǎn)染效果的檢測：以不同MOI的慢病毒轉(zhuǎn)染心肌細胞，在倒置熒光顯微鏡下觀察，計算熒光陽性細胞百分比，發(fā)現(xiàn)MOI=50時病毒轉(zhuǎn)染率最高。Western Blot檢測各組細胞中β3-AR蛋白表達水平，與NE組和空病毒轉(zhuǎn)染組相比，病毒轉(zhuǎn)染組β3-AR

6、表達增加（P<0.05），結(jié)果說明構(gòu)建的β3-AR慢病毒可以有效提高原代心肌細胞中β3-AR的表達；
　?。?）過表達β3-AR對心肌肥厚的影響：病毒轉(zhuǎn)染24h后，用NE誘導(dǎo)細胞48h，用Western Blot和qRT-PCR方法檢測原癌基因c-myc、c-fos表達變化。與空白對照組相比， NE組、β3-AR組、空病毒組c-myc、c-fos蛋白水平和RNA水平的表達均上調(diào)（P<0.05），其中β3-AR組明顯高于NE組（P<

7、0.05），說明隨β3-AR表達增加，心肌肥厚加重；
　　（4）β3-AR表達增高影響MAPK通路的激活：Western Blot檢測各組細胞p38MAPK和ERK1/2磷酸化水平，qRT-PCR檢測各組細胞中p38MAPK和ERK的mRNA表達，結(jié)果顯示NE組、β3-AR組、空病毒組的p38MAPK、MEK/ERK蛋白磷酸化水平和RNA表達明顯高于對照組（P<0.05），其中β3-AR轉(zhuǎn)染組p38MAPK、MEK、ERK1/2表