喜樹(shù)堿對(duì)HaCaT細(xì)胞、人原代角質(zhì)形成細(xì)胞自噬及凋亡的影響.pdf

1、目的:觀察喜樹(shù)堿對(duì)HaCaT細(xì)胞、人原代角質(zhì)形成細(xì)胞（KCs）自噬和凋亡的影響，從而探討喜樹(shù)堿治療銀屑病的機(jī)制。
　　方法:①將HaCaT細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為0.1%二甲基亞砜（DMSO），實(shí)驗(yàn)組分別為5、10、25、50、100、200 nmol/L濃度的喜樹(shù)堿。藥物處理細(xì)胞24、48 h，用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物作用24 h的細(xì)胞凋亡情況，Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋

2、白1輕鏈3（LC3）、p62的變化，選取10 nmol/L喜樹(shù)堿作用于HaCaT細(xì)胞24 h，間接免疫熒光法觀察細(xì)胞自噬蛋白LC3的變化，透射電鏡觀察自噬體超微結(jié)構(gòu)，確認(rèn)喜樹(shù)堿對(duì)HaCaT細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)效應(yīng)。
　?、谌⌒邪きh(huán)切術(shù)青少年的包皮組織，分離提取人原代角質(zhì)形成細(xì)胞，取第三代細(xì)胞用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組喜樹(shù)堿濃度為200nmol/L、2μmol/L、6μmol/L，對(duì)照組為0.1% DMSO，藥物處理細(xì)胞24h、48h后，采用

3、CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物作用24 h的細(xì)胞凋亡情況，Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、p62的變化，選取2μmol/L濃度喜樹(shù)堿作用于細(xì)胞24 h，間接免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞自噬蛋白LC3的變化，透射電鏡觀察自噬體超微結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步確認(rèn)喜樹(shù)堿對(duì)其自噬的誘導(dǎo)效應(yīng)，免疫組化觀察銀屑病皮損部位和正常表皮LC3表達(dá)水平。
　?、劢y(tǒng)計(jì)學(xué)分析：統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0軟件，計(jì)量資料以?x±s表示。各均數(shù)經(jīng)Le

4、vene檢驗(yàn)方差齊性。細(xì)胞的增殖抑制率以及凋亡率統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析，各組間的多重比較采用Dunnett t檢驗(yàn)，間接免疫熒光檢測(cè)自噬體陽(yáng)性細(xì)胞率采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:①5、10、25 nmol/L喜樹(shù)堿對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖、凋亡無(wú)顯著影響，50、100、200nmol/L喜樹(shù)堿作用 HaCaT細(xì)胞24 h的增殖抑制率分別為(31.23±1.00)%，(54.21±8.10)%，(

5、66.75±10.70)%；25、50、100、200nmol/L喜樹(shù)堿作用 HaCaT細(xì)胞48h的增殖抑制率分別為(25.81±5.99)%、(44.35±5.32)%、(65.81±8.28)%、(73.23±9.59)%，與相同時(shí)段的對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p均<0.001）。50、100、200nmol/L喜樹(shù)堿作用 HaCaT細(xì)胞24 h的凋亡率分別為(14.46±2.38)%、(19.15±1.59)%、(29.88±

6、1.37)%，與對(duì)照組(3.80±0.13)%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.001）。5、10 nmol/L喜樹(shù)堿處理HaCaT細(xì)胞24 h后，LC3Ⅱ表達(dá)上調(diào)，p62蛋白表達(dá)下調(diào)。間接免疫熒光觀察到10nmol/L喜樹(shù)堿作用細(xì)胞24h后的綠色熒光聚集點(diǎn)明顯增多，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的自噬體陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別為（36.67±4.55）%、6.23±0.92）%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.546，p=0.0028）。透射電鏡觀察到10n

7、mol/L喜樹(shù)堿作用細(xì)胞24h自噬體和自噬溶酶體的形成。
　?、?μmol/L、6μmol/L喜樹(shù)堿作用原代角質(zhì)形成細(xì)胞24 h的增殖抑制率分別為（33.90±3.65）%、（51.72±5.06）%，與對(duì)照組（1.60±0.78）%相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,200nmol/L喜樹(shù)堿作用原代角質(zhì)形成細(xì)胞24 h的增殖抑制率為（7.59±1.82）%，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。200nmol/L、2μmol/L、6μmol/L喜樹(shù)堿

8、作用原代角質(zhì)形成細(xì)胞48 h的增殖抑制率分別為（19.21±5.74）%、（52.09±3.01）%、（63.37±5.45）%，與對(duì)照組（4.18±1.56）%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。200nmol/L、2μmol/L、6μmol/L喜樹(shù)堿作用原代角質(zhì)形成細(xì)胞24 h的凋亡率分別為（15.90±2.14）%、（29.33±3.51）%、（35.28±3.05）%，與對(duì)照組（2.30±1.68）%比較，差異有統(tǒng)計(jì)意義。2μmol/L、6

9、μmol/L喜樹(shù)堿處理原代角質(zhì)形成細(xì)胞24 h后，LC3Ⅱ顯著上調(diào)，p62蛋白表達(dá)下調(diào)。間接免疫熒光觀察到2μmol/L喜樹(shù)堿作用原代角質(zhì)形成細(xì)胞24h后的綠色熒光聚集點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的自噬體陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別為（60.16±8.78）%、（38.96±13.12）%，統(tǒng)計(jì)方法采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.003，p=0.017）。透射電鏡觀察到2μmol/L喜樹(shù)堿作用原代角質(zhì)形成細(xì)胞24h自噬體和自噬溶酶體的形成；