肝素對(duì)高糖誘導(dǎo)的水通道蛋白在人腹膜間皮細(xì)胞上表達(dá)的影響.pdf

1、目的：水通道蛋白(aquaporin，AQP)是Agre等人于1988年分離紅細(xì)胞Rh血型抗原的一段32KD多肽的過(guò)程中無(wú)意得到的一段28KD的多肽，后來(lái)被證實(shí)為介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外水轉(zhuǎn)運(yùn)的通道，在微生物、植物、哺乳動(dòng)物中廣泛存在，并在多種器官的生理和病理中發(fā)揮重要作用。本研究旨在通過(guò)肝素對(duì)葡萄糖誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞(human perotonealnesothelial cells，HPMCs)對(duì)AQP1、AQP3mRNA及蛋白表達(dá)的

2、影響。 方法：從連續(xù)不臥床腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis，CAPD)治療的慢性腎臟病患者腹膜透析流出液中分離并培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞，第二代細(xì)胞應(yīng)用免疫組化方法進(jìn)行細(xì)胞鑒定，第三代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，分別按照不同的實(shí)驗(yàn)要求分成2.5％葡萄糖組、2.5％葡萄糖加2.5×10-3mg/ml肝素組、2.5％葡萄糖加5×10-3mg/ml肝素組、2.5％葡萄糖加1.5×10-2mg/m

3、l肝素組。采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)半定量分HPMCs中AQP1、AQP3mRNA的表達(dá)水平，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)HPMCs 上AQP1、AQP3的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果： 一、葡萄糖及肝素誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞AQP1、AQP3mRNA的影響1、用2.5％葡萄糖、2.5％葡萄糖加2.5×10-3mg/ml肝素分別處理H

4、PMC不同時(shí)間后檢測(cè)，結(jié)果顯示葡萄糖可顯著誘導(dǎo)間皮細(xì)胞表達(dá)AQP1mRNA上調(diào)，并隨時(shí)間延長(zhǎng)而增多，與無(wú)糖組比較具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且AQP1mRNA表達(dá)量在24小時(shí)最大(t=-53.576，P<0.01)。而葡萄糖組與葡萄糖加肝素組比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 2、用2.5％葡萄糖、2.5％葡萄糖加2.5×10-3mg/ml肝素分別處理HPMC不同時(shí)間后檢測(cè)，結(jié)果顯示葡萄糖可顯著誘導(dǎo)間皮細(xì)胞表達(dá)AQP3mRNA上調(diào)

5、，并隨時(shí)間延長(zhǎng)而增多，與無(wú)糖組比較具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且AQP3mRNA表達(dá)量在24小時(shí)最大(t=-43.743，P<0.01)。而葡萄糖組與葡萄糖加肝素組比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 3、用2.5％葡萄糖、2.5％葡萄糖加不同濃度的肝素(2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml、1.5×10-2mg/ml)分別處理HPMC 4小時(shí)后，檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)AQP1mRNA的變化。結(jié)果顯示葡萄糖及葡萄糖加肝素組AQP

6、1mRNA表達(dá)均高于無(wú)糖組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，但葡萄糖組與葡萄糖加2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml肝素組比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而葡萄糖加1.5×10-2mg/ml肝素組比葡萄糖組AQP1mRNA的表達(dá)量明顯增加(t=-37.676，P<0.05)。 4、用2.5％葡萄糖、2.5％葡萄糖加不同濃度的肝素(2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml、1.5×10-2mg/ml

7、)分別處理HPMC 4小時(shí)后，檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)AQP3mRNA的變化。結(jié)果顯示葡萄糖及葡萄糖加肝素組AQP3mRNA表達(dá)均高于無(wú)糖組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，但葡萄糖組與葡萄糖加2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml肝素組比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而葡萄糖加1.5×10-2mg/ml肝素組比葡萄糖組AQP3mRNA的表達(dá)量明顯增加(t=-30.578， P<0.05)。 二、葡萄糖及肝素誘導(dǎo)腹膜間皮

8、細(xì)胞AQP1、AQP3的影響免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示無(wú)糖組見(jiàn)棕黃色顆粒主要分布在胞漿和胞膜上；與無(wú)糖組比較，葡萄糖和葡萄糖加肝素組陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，胞核上亦可見(jiàn)棕黃色深染顆粒，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；AQP1蛋白表達(dá)在葡萄糖加1.5×10-2mg/ml肝素組與葡萄糖組及葡萄糖加2.5×10-33mg/ml、5×10-3mg/ml肝素組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有明顯差異(t=4.405，6.066，4.983，P<0.01)；AQP3蛋白表

9、達(dá)在葡萄糖加1.5×10-2mg/ml肝素組與葡萄糖組及2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml肝素組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析亦有明顯差異(t=3.412，5.484，3.667，P<0.01)；而葡萄糖組與葡萄糖加2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml肝素組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。葡萄糖組及葡萄糖加1.5×10-22mg/ml肝素組細(xì)胞免疫組化圖片可見(jiàn)胞核及胞漿有空泡樣變，而葡萄糖加常規(guī)劑量肝素組無(wú)明顯空泡