血必凈對(duì)脂多糖及高糖作用下大鼠腹膜間皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響.pdf

1、腹膜透析是終末期腎臟病主要替代療法之一。但在長(zhǎng)期的腹膜透析過(guò)程中，不可避免地發(fā)生腹膜透析相關(guān)性腹膜炎，引起腹膜炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及腹膜細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，最終導(dǎo)致腹膜透析失敗。脂多糖（lipopolysaceharide，LPS）是大腸桿菌的主要致病物質(zhì)，是其唯一內(nèi)毒素。LPS主要來(lái)源于長(zhǎng)期腹膜透析引起的導(dǎo)管相關(guān)性感染，其次腸道內(nèi)細(xì)菌可穿過(guò)通透性增高的腸壁進(jìn)入腹腔。LPS和腹膜透析液中的高濃度葡萄糖是引起腹膜炎性改變和腹膜纖維化的主要原因。腹

2、膜間皮細(xì)胞作為腹膜的主要構(gòu)成細(xì)胞，是腹膜透析時(shí)與腹膜透析液接觸的第一道生理屏障，是腹膜損傷反應(yīng)的第一步。研究腹膜間皮細(xì)胞在LPS及高糖作用下的反應(yīng)是研究腹膜損傷機(jī)制和干預(yù)腹膜損傷的基礎(chǔ)。
　　 腫瘤壞死因子可啟動(dòng)IL-1等多種炎癥因子的表達(dá)和分泌，是一種非常重要的早期炎癥因子。高遷移率族蛋白-1（high mobility group box-1，HMGB-1）是新近發(fā)現(xiàn)的晚期炎癥介質(zhì)，參與了內(nèi)毒素的致死效應(yīng)。而LPS和TNF-

3、α均可刺激HMGB-1的合成，HMGB-1反過(guò)來(lái)又可延遲激活體內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞，引起TNF-α水平再度增高，二者相互誘生、相互促進(jìn)，從而使炎癥反應(yīng)不斷放大，持續(xù)加重組織損害。同時(shí)，HMGB-1的遷移性也是決定特定細(xì)胞壞死或凋亡的關(guān)鍵信號(hào)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）是一種多功能炎癥活性因子，是直接聯(lián)系腹膜炎與腹膜纖維化的關(guān)鍵因子。我們通過(guò)研究細(xì)菌脂多糖（li

4、poplysaccharide，LPS）對(duì)PMC分泌TNF-α、HMGB-1和TGF-β1的影響及三者之間可能存在的關(guān)系，進(jìn)一步探討腹膜炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程及其介導(dǎo)腹膜損傷和纖維化發(fā)生的可能機(jī)制。
　　 血必凈是中藥復(fù)方制劑，在治療多種炎癥及纖維化疾病中具有較好療效。本研究通過(guò)觀察血必凈對(duì)脂多糖作用下大鼠腹膜間皮細(xì)胞TNF-α和HMGB-1表達(dá)的影響，探討血必凈能否通過(guò)抑制二者的表達(dá)，起到抑制炎癥擴(kuò)大、保護(hù)腹膜的作用。另外，我們還通

5、過(guò)觀察血必凈對(duì)高糖誘導(dǎo)的PMC HMGB-1及TGF-β1表達(dá)的影響，明確血必凈是否具有抑制高糖對(duì)PMC分泌細(xì)胞因子的作用，從而保護(hù)PMC，發(fā)揮潛在的抗腹膜纖維化作用。
　　 方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物
　　 雄性SD大鼠（體重120-160g，清潔級(jí)，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。
　　 2、胰蛋白酶消化法分離培養(yǎng)大鼠PMC，用RT-PCR法檢測(cè)HMGB-1mRNA的表達(dá)，ELISA法測(cè)TNF-α

6、、HMGB-1和TGF-β1蛋白表達(dá)。
　　 細(xì)胞分組：
　　 （1）不同濃度LPS組：0，1，10，100mg/L
　　 （2）10mg/L LPS作用不同時(shí)間組：0，2，6，12，18，21，24，36h
　　 （3）10mg/L LPS預(yù)孵育2h后，加入不同濃度血必凈（2，10，20g/L）再作用4，22h
　　 （4）2.5％高糖作用不同時(shí)間組：0，18，24，36h.
　　 （5

7、）2.5％高糖加入不同濃度血必凈（2，10，20g/L）再作用18，24，36h
　　 結(jié)果：
　　 1、LPS對(duì)PMC HMGB-1表達(dá)的影響
　　 1mg/L LPS可使PMC的HMGB-1mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)增加（P<0.05），100mg/L LPS作用最強(qiáng)（P<0.01）；10mg/L LPS作用18h后PMC的HMGB-1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)增加（P<0.05），36h時(shí)表達(dá)達(dá)最大（P<0.01）。

8、
　　 2、LPS對(duì)PMC TNF-α表達(dá)的影響
　　 1mg/L LPS可使PMC的TNF-α蛋白質(zhì)表達(dá)增加（P<0.05），100mg/L LPS作用最強(qiáng)（P<0.01）；10mg/L LPS刺激PMC，TNF-α的含量在LPS刺激后2h開(kāi)始增高并達(dá)峰值，6h到18h表達(dá)降低，于21h表達(dá)增高達(dá)另一峰值（P<0.05）。
　　 3、LPS對(duì)PMC TGF-β1表達(dá)的影響
　　 TGF-β1的含量在10

9、mg/L LPS刺激后2h開(kāi)始增高并達(dá)峰值，6h降低，12h開(kāi)始增高并持續(xù)至36h（P<0.05）。
　　 4、血必凈對(duì)LPS作用下PMC HMGB-1表達(dá)的影響
　　 10g/L血必凈可抑制經(jīng)10mg/L LPS預(yù)孵育2h后的PMC HMGB-1mRNA表達(dá)（P<0.05）；2g/L血必凈可抑制10mg/L LPS預(yù)孵育2h后的PMC HMGB-1蛋白質(zhì)表達(dá)（P<0.05），20g/L血必凈的這種抑制作用最強(qiáng)（P<0.

10、01）。
　　 5、血必凈對(duì)LPS作用下PMC的TNF-α蛋白表達(dá)的影響
　　 2g/L血必凈可抑制10mg/L LPS預(yù)孵育2h后的PMC TNF-α蛋白的表達(dá)（P<0.05），20g/L血必凈組的抑制作用更強(qiáng)（P<0.01）。
　　 6、高糖對(duì)PMC的HMGB-1和TGF-β1表達(dá)的影響
　　 2.5％高糖作用18h后PMC的HMGB-1和TGF-β1表達(dá)增加（P<0.05），作用36h后二者表達(dá)達(dá)最

11、大（P<0.01）。
　　 7、血必凈對(duì)高糖作用下PMC的HMGB-1和TGF-β1表達(dá)的影響
　　 加血必凈的葡萄糖組HMGB-1及TGF-β1的含量均顯著低于高糖組（P<0.05），且隨著血必凈濃度升高，HMGB-1及TGF-β1的含量下降，20g/L血必凈組兩者含量最低。
　　 結(jié)論：
　　 1、HMGB-1作為晚期炎癥因子參與了腹膜透析相關(guān)性腹膜炎的病理過(guò)程，LPS通過(guò)上調(diào)TNF-α、HMGB-1