MG132對(duì)高糖、脂多糖刺激下纖維化大鼠腹膜間皮細(xì)胞ERK1-2,CTGF表達(dá)的影響.pdf

1、背景:
　　 腹膜透析相關(guān)性腹膜炎是腹膜透析患者退出腹膜透析的常見(jiàn)原因，腹膜透析液的生理不相容性包括高糖、低PH、高滲、葡萄糖代謝產(chǎn)物以及反復(fù)的腹膜感染都是導(dǎo)致腹膜纖維化的常見(jiàn)因素。如何維持腹膜透析功能，延長(zhǎng)腹膜透析時(shí)間成為我們面臨的主要問(wèn)題。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用脂多糖與高糖刺激腹膜間皮細(xì)胞，觀察相關(guān)指標(biāo)的變化及意義。
　　 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員，激活后的MAPK

2、可轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，并激活一些核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控核內(nèi)基因表達(dá)，引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，如:細(xì)胞增殖、遷移、纖維化等。有研究證明，糖尿病腎病早期腎小球內(nèi)ERK1/2活性顯著增加，ERK1/2活化狀態(tài)誘導(dǎo)腎小球細(xì)胞肥大及多種生長(zhǎng)因子表達(dá)。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)的下游因子，二者參與了多種器官和組織的細(xì)胞外機(jī)制的合成，同樣參與了腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展。
　　 泛素-蛋白酶體途徑(UPP)是廣泛存在于真核細(xì)胞胞漿

3、中依賴ATP的非溶酶體蛋白降解途徑，MG132是泛素蛋白酶體途徑中26s蛋白酶體抑制劑，有相關(guān)研究證實(shí)，MG132具有抑制腎臟間質(zhì)纖維化的潛在作用。因此，我們擬從大鼠腹膜間皮細(xì)胞內(nèi)研究進(jìn)而探討泛素蛋白酶體途徑是否參加了腹膜纖維化，進(jìn)而為防治腹膜炎相關(guān)腹膜纖維化提供新思路。
　　 目的:
　　 探討在高糖、脂多糖的作用下泛素蛋白酶體途徑對(duì)大鼠腹膜間皮細(xì)胞(RPMCs)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)影響，并

4、用蛋白酶體抑制劑MG132為阻斷劑，觀察泛素蛋白酶體途徑在腹膜纖維化中的作用。進(jìn)而為防治腹膜透析相關(guān)的腹膜炎及腹膜纖維化提供新思路。
　　 方法:
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:清潔級(jí)SD雄性大鼠，體重130-170克，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
　　 2、胰蛋白酶消化法分離培養(yǎng)RPMCs，用細(xì)胞角蛋白抗體及波形蛋白抗體行免疫組化染色進(jìn)行鑒定，明確其為RPMC。Western印跡法檢測(cè)t-ERK1/2、p-ERK1/

5、2蛋白的表達(dá)。ELISA檢測(cè)上清液CTGF的表達(dá)。
　　 3、實(shí)驗(yàn)分組
　　 (1)正常對(duì)照組:只加2％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基;
　　 (2)脂多糖不同濃度組:不同濃度的脂多糖(0，1，10，100μg/ml)分別作用24h;
　　 (3)脂多糖作用不同時(shí)間組:10μg/ml脂多糖分別作用0，12，24，48 h;
　　 (4)脂多糖加MG132干預(yù)組:MG132(0.5，1，2μmol

6、/L)分別作用30min后，各加入10μg/ml LPS孵育24小時(shí);
　　 (5)葡萄糖作用不同濃度組:不同濃度的葡萄糖(0，1.5％，2.5％，4.25％)分別作用24h;
　　 (6)葡萄糖作用不同時(shí)間組:2.5％高糖分別作用0，12，24，48 h;
　　 (7)高糖加MG132干預(yù)組:MG132(0.5，1，2μmol/L)分別作用30min后，各加入2.5％高糖孵育24h;
　　 結(jié)果:

7、>　　 1、LPS對(duì)RPMCs ERK1/2蛋白表達(dá)的影響:10μg/ml LPS作用RPMCs不同時(shí)間后，與0h對(duì)比，各時(shí)間組p-ERK1/2蛋白表達(dá)增加(P＜0.01);24小時(shí)p-ERK1/2蛋白表達(dá)量最高(P＜0.01）;各組t-ERK1/2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、LPS對(duì)RPMCs CTGF蛋白表達(dá)的影響:不同濃度的LPS組上清液中CTGF濃度顯著高于對(duì)照組(P＜0.05），脂多糖100μg/ml時(shí)表達(dá)

8、量最大(P＜0.05）。脂多糖10μg/ml作用不同時(shí)間后，各時(shí)間組與0h相比，CTGF蛋白表達(dá)量升高(P＜0.05），48 h時(shí)內(nèi)呈時(shí)間依賴性(P＜0.05)。
　　 3、MG132對(duì)LPS作用下RPMC ERK1/2蛋白表達(dá)的影響:與正常組相比，10μg/ml LPS組p-ERK1/2蛋白表達(dá)升高(P＜0.01);1μmol/L MG132可下調(diào)10μg/mlLPS作用下的RPMCs的p-ERK1/2蛋白表達(dá)(P＜0.01）

9、，各組t-ERK1/2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4、MG132對(duì)LPS刺激下CTGF蛋白表達(dá)的影響:與正常組相比，10μg/mlLPS組CTGF蛋白表達(dá)升高(P＜0.05);經(jīng)過(guò)不同濃度MG132干預(yù)后，與10μg/mlLPS相比，CTGF蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），且呈藥物濃度依賴性，MG1322μmol/L時(shí)，CTGF表達(dá)量最低(P＜0.05)。
　　 5、葡萄糖對(duì)RPMCs ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

10、:2.5％葡萄糖作用RPMCs不同時(shí)間組，與0 h組相比，各組p-ERK1/2蛋白表達(dá)增加(P＜0.01），24小時(shí)p-ERK1/2蛋白表達(dá)最高(P＜0.01），各組t-ERK1/2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6、高糖對(duì)RPMCs CTGF蛋白表達(dá)的影響:不同濃度高糖刺激組與對(duì)照組相比，CTGF表達(dá)量增加(P＜0.05），且呈葡萄糖濃度依賴性。2.5％高糖作用相應(yīng)時(shí)間后，各時(shí)間組與0h相比，CTGF蛋白表達(dá)量升高(P＜0.

11、05），且在48 h時(shí)內(nèi)呈時(shí)間依賴性(P＜0.05)。
　　 7、MG132對(duì)高糖刺激下ERK1/2蛋白表達(dá)的影響:各組分別作用24 h后，與正常對(duì)照組相比，2.5％高糖組p-ERK1/2蛋白表達(dá)量明顯升高(P＜0.01);MG1321μmol/L干預(yù)后，與2.5％高糖刺激組相比，p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.01)。各組t-ERK1/2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 8、MG132對(duì)高糖刺激下CTGF蛋白

12、表達(dá)的影響:與正常組相比，2.5％高糖組CTGF蛋白表達(dá)升高(P＜0.01);MG132干預(yù)后，各藥物組與2.5％高糖組相比，CTGF蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)，呈藥物濃度依賴性。
　　 結(jié)論:
　　 1、高糖、脂多糖可以通過(guò)泛素蛋白酶體途徑刺激大鼠腹膜間皮細(xì)胞相關(guān)炎癥、纖維化因子ERK1/2，CTGF的表達(dá)。
　　 2、MG132通過(guò)阻斷泛素蛋白酶體途徑，抑制ERK1/2，CTGF的表達(dá)。