羅格列酮對肽聚糖作用下及高糖本身對大鼠腹膜間皮細(xì)胞TLR2表達(dá)的影響.pdf

1、腹膜透析是治療終末期腎臟病的重要手段，具有血液透析無法替代的優(yōu)勢，在長期的腹膜透析過程中，不可避免地發(fā)生腹膜透析相關(guān)性腹膜炎，引起腹膜炎癥細(xì)胞的浸潤及腹膜細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，最終導(dǎo)致腹膜透析失敗，在腹膜透析相關(guān)性腹膜炎中，以細(xì)菌感染為主，其中又以革蘭氏陽性細(xì)菌感染最為多見。革蘭氏陽性細(xì)菌的胞壁成分肽聚糖(peptidoglycan，PGN)是其特征性成分，具有致炎作用。腹膜間皮細(xì)胞作為腹膜的主要構(gòu)成細(xì)胞，是腹膜透析時與腹膜透析液接觸的第一

2、道生理屏障，是腹膜損傷反應(yīng)的第一步。在腹膜透析相關(guān)性腹膜炎中，腹膜間皮細(xì)胞既是炎癥反應(yīng)的參與者，又是受害者。研究腹膜間皮細(xì)胞在PGN作用下的反應(yīng)是研究腹膜透析相關(guān)性腹膜炎中干預(yù)腹膜損傷措施的基礎(chǔ)。 Toll樣受體家族是重要的膜受體家族，TLRs蛋白是由胚系基因編碼的，是多種病原相關(guān)模式分子(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)的受體，最近的研究表明，哺乳動物在對多種病原成分發(fā)

3、生的直接天然免疫反應(yīng)中牽涉到Toll樣受體的作用，由 Toll 樣受體介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)是感染因子侵入機(jī)體的第一道防線。到目前為止，在哺乳動物中至少 TLRs 家族的十名成員已被發(fā)現(xiàn)。體外實驗表明，作為 Toll 樣受體家族成員之一的 TLR2 的存在使細(xì)胞對 PGN 發(fā)生反應(yīng)，應(yīng)用包藏 TLR2 無效等位基因的小鼠進(jìn)行的體內(nèi)實驗，同樣為證明 PGN 誘導(dǎo)的信號反應(yīng)是由TLR2執(zhí)行提供了有力證據(jù)。由 PGN 誘導(dǎo)的 TLR2 的活化通過

4、激活核因子kappa B(NF-kB)而最終誘導(dǎo)免疫細(xì)胞釋放炎癥因子，如TNF-α等，這些炎癥因子的釋放可促進(jìn)腹腔白細(xì)胞的聚集，刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致腹膜纖維化、超濾失敗。 過氧化物酶增殖物激活受體(peroxisome proliferators activated receptors，PPARs)屬核受體超家族成員，在細(xì)胞內(nèi)PPARs通過與維甲酸類X受體結(jié)合進(jìn)而與DNA結(jié)合，從而起到調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的作用。作為過氧化物酶

5、增殖物激活受體(PPAR)三種表型之一的PPARγ，在糖尿病治療中具有重要作用，它能夠加強(qiáng)胰島素引起的葡萄糖攝取作用。此外，PPARγ同樣能夠抑制炎癥反應(yīng)，相關(guān)的信號通路包括：①JAK-STAT；②NF-κB；⑧活化T細(xì)胞核因子(NFAT)；④AP-1等。通過觀察PPARγ激動劑羅格列酮對肽聚糖作用下大鼠腹膜間皮細(xì)胞toll-likereceptor 2(TLR2)表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討PPARγ激動劑羅格列酮能否通過抑制TLR2表達(dá)

6、起到抑制炎癥擴(kuò)大、保護(hù)腹膜的作用提供基礎(chǔ)。 另外，腹膜透析液中的高濃度葡萄糖亦是引起腹膜炎性改變和腹膜纖維化的重要原因之一。有研究表明，高濃度葡萄糖可以促進(jìn)腹膜間皮細(xì)胞表達(dá)IL-1等炎癥介質(zhì)。本研究通過觀察高糖對TLR2表達(dá)的影響，從而探討在無感染情況下高糖引起腹膜損傷的具體機(jī)制。 方法： 1、實驗用動物：SD大鼠(體重120-160g，清潔級，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)。胰蛋白酶消化法分離培養(yǎng)RPMCs，

7、用RT-PCR法檢測TLR2mRNA的表達(dá)，流式細(xì)胞分析儀檢測TLR2蛋白表達(dá)。 2、細(xì)胞分組：(1)不同濃度肽聚糖組：0，1.0，10，100μg/ml；(2)10μg/ml肽聚糖作用不同時間組：0，2，6，12h組；(3)10μg/ml PGN預(yù)孵育2h后，再加入羅格列酮；(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)作用4h組(檢測TLR2蛋白質(zhì))；(4)10μg/ml PGN預(yù)孵育2h后，再加入羅格列酮10μmo

8、l/L作用4h組(檢測TLR2mRNA)；(5)不同濃度高糖組：0，1.5％，2.5％，4.25％；(6)2.5％高糖作用不同時間組：0，5，10，20h。 結(jié)果： 1、PGN對RPMCs的TLR2表達(dá)的影響1.0μg/ml PGN可使RPMCs的TLR2mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)增加(P<0.05)，100μg/ml PGN作用最強(qiáng)(P<0.01)；10μg/ml PGN作用2h后RPMCs的TLR2mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)增加

9、(P<0.05)，12h時TLR2mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)達(dá)最大(P<0.01)。 2、羅格列酮對在PGN刺激下的RPMCs的TLR2表達(dá)的影響10μmol/L羅格列酮可抑制經(jīng)10μg/mlPGN預(yù)孵育2h后的RPMCs的TLR2mRNA表達(dá)(P<0.05)；5μmol/L羅格列酮可抑制在10μg/mlPGN預(yù)孵育2h后的RPMCs的TLR2蛋白質(zhì)表達(dá)(P<0.05)，20μmol/L羅格列酮的這種抑制作用最強(qiáng)(P<0.01)。

10、 3、高糖對RPMCs的TLR2表達(dá)的影響1.5％高糖可使RPMCs的TLR2mRNA表達(dá)增加(P<0.05)，4.25％高糖作用最強(qiáng)(P<0.01)；2.5％高糖作用5h后RPMCs的TLR2mRNA表達(dá)增加(P<0.05)，作用20h后TLR2mRNA表達(dá)達(dá)最大(P<0.01)。 結(jié)論： 1、RPMCs存在TLR2的表達(dá)。 2、PGN可以從基因和蛋白水平以濃度和時間依賴方式上調(diào)體外培養(yǎng)的RPMCs的TLR