姜黃素對(duì)腹膜透析相關(guān)性腹膜炎大鼠腹膜TLR2，TLR6及TNF-α表達(dá)的影響.pdf

1、目的： 腹膜透析相關(guān)性腹膜炎是腹膜透析過(guò)程中最常見(jiàn)的并發(fā)癥。在腹膜透析相關(guān)性腹膜炎中，以革蘭氏陽(yáng)性菌感染為主。病理改變主要表現(xiàn)為腹膜層單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和腹膜間皮細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，最終導(dǎo)致腹膜透析失敗。因此，如何對(duì)其進(jìn)行防治一直是臨床研究的熱點(diǎn)。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類可以識(shí)別保守的病原相關(guān)分子模式(pathogenassociated molecular pattems，PAMPs

2、)的跨膜受體，是機(jī)體天然免疫的重要組成部分。通過(guò)對(duì)PAMPs的識(shí)別，TLRs在機(jī)體抵御病毒及病菌感染的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。迄今為止，在人類中鑒定出10種TOLL樣蛋白(TLR1-10)。在這些TLRs中，TLR2和TLR6被發(fā)現(xiàn)與革蘭氏陽(yáng)性菌成分肽聚糖(peptidoglycan，PGN)和質(zhì)膜酸(lipoteichoic acid，LTA)的識(shí)別有關(guān)。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)是80年代發(fā)現(xiàn)的

3、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌的一種重要的細(xì)胞因子。具有多種生物效應(yīng)，主要是介導(dǎo)抗腫瘤及調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，并且參與炎癥病變的多方面病理生理變化。姜黃素是一種從姜科植物Curcumalonga的根莖姜黃中提取的一種植物多酚，有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗凝、抗腫瘤、抗突變等多方面的藥理作用研究表明，姜黃素作為一種免疫調(diào)節(jié)劑可以調(diào)控T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性與數(shù)量。姜黃素也可在一些炎癥中下調(diào)一些炎性反應(yīng)因子，如腫

4、瘤壞死因子、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1，-2，-6，-8，-12等。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究姜黃素對(duì)表皮葡萄球菌所致的急性腹膜炎過(guò)程中TLR2、TLR6和TNF-α的表達(dá)的影響。 材料與方法 一、實(shí)驗(yàn)分組 SD大鼠，雌雄并用，共72只，體重250-300g，隨機(jī)分為2組，姜黃處理組和無(wú)姜黃處理組。每組內(nèi)動(dòng)物再分為6小組，除第1組給予等量生理鹽水外，其余各組動(dòng)物給予表皮葡萄球菌腹腔注射(107/ml

5、colony-formingunits，dilutedin3.86％dialysate)制作急性腹膜炎模型。姜黃處理組在腹腔注射皮葡萄球菌前18小時(shí)給予姜黃素腹腔注射(1mg/kg)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活3，6，12，24和48h后過(guò)量麻藥處死，取腹水及眼血做常規(guī)腹水及血常規(guī)檢測(cè)；取出腹膜處理備用。 二、檢測(cè)方法 1、腹膜的組織學(xué)改變將切片置于蘇木精染色液中15-20min，自來(lái)水沖洗；后切片置于0.5％HCL酒精中數(shù)秒，自來(lái)水

6、洗3次后稍浸泡；切片置于伊紅染色液中2-3min。切片脫水，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察結(jié)果。 2、免疫組織化學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后，常規(guī)灌流、固定、取材、切片，3％H2O210min，BSA封閉1h，TLR2、TLR6和TNF-α一抗孵育過(guò)夜(4℃)，二抗常溫孵育2h，SABC常溫孵育1h，DAB顯色，3、TLR2、TLR6和TNF-α的蛋白質(zhì)表達(dá)過(guò)量麻藥處死動(dòng)物，迅速取大腦并剝離海馬，樣品剪碎后加入裂解液4℃過(guò)夜?？捡R斯亮藍(lán)法進(jìn)行

7、蛋白定量，各組取等量蛋白，聚丙酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上；脫脂奶粉溶液封閉3-7h；TLR2、TLR6和TNF-α一抗孵育過(guò)夜(4℃)；二抗常溫下孵育2h；后進(jìn)行顯色、曝光、膠片掃描、定量分析。 4、TLR2、TLR6和TNF-α的mRNA表達(dá)采用Trizol一步法提取大鼠腹膜總RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用引物為：TLR2(5'-GGAGGTGTTGGATGTTAG-3'；5'-GCTTGAAGGGTGGGTC-3')

8、；TLR6(5'-ACTCACCAGAGGTCCAA-3'；5'-GGATGAATGGCGTGTC-3')；TNF-a(5'-GCCACCACGCTCTTCTG-3'，5'-GCAGCCTTGTCCCTTGA-3').PCR擴(kuò)增后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用3％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離觀察，成像，Image-proPlus6.0軟件包分析。 結(jié)果： 一、腹水白細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果腹腔注射表皮葡萄球菌后3小時(shí)，腹水白細(xì)胞開(kāi)始升高。姜黃處理組與

9、非姜黃處理組相比，姜黃素處理組腹水白細(xì)胞在腹腔注射表皮葡萄球菌后3h、6h、12h、24h數(shù)量減少且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 二、HE染色結(jié)果實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔注射表皮葡萄球菌后，腹膜出現(xiàn)水腫和細(xì)胞形態(tài)改變。選取腹腔注射表皮葡萄球菌后24h的腹膜切片對(duì)比，非姜黃素處理組腹膜間皮細(xì)胞損傷嚴(yán)重，細(xì)胞變形、碎裂；姜黃素處理組也存在一定程度的間皮細(xì)胞變形碎裂，但程度較非姜黃素處理組為輕。 三、TLR2、TLR6和TNF-α免疫組織化學(xué)結(jié)果TLR

10、2和TLR6免疫陽(yáng)性反應(yīng)主要位于腹膜間皮細(xì)胞。對(duì)于未注射表皮葡萄球菌的對(duì)照動(dòng)物，姜黃素處理組與非姜黃素處理組TLR2和TLR6免疫陽(yáng)性無(wú)明顯差別。姜黃素處理組與非姜黃素處理組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在注射表皮葡萄球菌后3h，6h，12h，24h，TLR2和TLR6免疫組織化學(xué)染色逐漸增強(qiáng)其在感染后48h則有所減弱。而與非姜黃素處理組相比，姜黃素處理組TLR2和TLR6免疫組織化學(xué)染色在注射表皮葡萄球菌后3h，6h，12h，24h明顯減弱，而在感染后4

11、8h則無(wú)明顯區(qū)別。此外，姜黃素處理組的細(xì)胞形態(tài)明顯好于非姜黃組處理組。TNF-α免疫染色自感染后3h開(kāi)始逐漸加深，24小時(shí)達(dá)到高峰。與無(wú)姜黃素處理組相比，姜黃素處理組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹膜的免疫反應(yīng)有著明顯的減輕。 四、TLR2、TLR6和TNF-α蛋白表達(dá)的Western-blot分析我們采用Western-blot技術(shù)對(duì)TLR2和TLR6的表達(dá)水平進(jìn)行分析。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，TLR2和TLR6的表達(dá)變化趨勢(shì)令人吃驚的非常相似，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明

12、TLR2和TLR6表達(dá)水平在感染后6h至24h呈時(shí)間依賴性上升。統(tǒng)計(jì)結(jié)果同時(shí)表明，與非姜黃素處理組相比，姜黃素處理組TLR2和TLR6表達(dá)含量在感染后6h/12h/24h明顯下降且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)TNF-α表達(dá)水平在感染后3h至24h呈時(shí)間依賴性上升。同時(shí)與非姜黃素處理組相比，姜黃素處理組TNF-α表達(dá)含量在感染后6h/12h/24h明顯下降且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 五、TLR2、TLR6和TNF-αmRNA表達(dá)的RT-P

13、CR分析我們采用RT-PCR技術(shù)對(duì)TLR2和TLR6mRNA水平表達(dá)進(jìn)行了分析。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，TLR2和TLR6mRNA表達(dá)趨勢(shì)是一致的，且其在感染后6h至24h呈時(shí)間依賴性上升。與非姜黃素處理組相比，姜黃素處理組TLR2和TLR6mRNA表達(dá)明顯減少并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TNF-α的mRNA表達(dá)在感染后6h至24h呈時(shí)間依賴性上升。與非姜黃素處理組相比，姜黃素處理組TNF-αmRNA表達(dá)明顯減少并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：