羅格列酮對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟VEGF表達(dá)的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：糖尿病腎病(diabeticnephropathy，DN)是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，是終末期腎功能衰竭的重要原因。糖尿病腎病的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，隨著世界范圍糖尿病患者人數(shù)的增加，闡明DN的發(fā)病機(jī)制，尋找和發(fā)現(xiàn)有效防治糖尿病腎病的新方法已成為醫(yī)學(xué)界研究的重要課題。近年已有研究證實(shí)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF，vascularendothelialgrowthfactor)在糖尿病腎病的發(fā)病過(guò)程中具有重要作用。已有報(bào)道V

2、EGF和VEGF受體在腎臟均有表達(dá)，VEGF通過(guò)與其特異性受體結(jié)合而發(fā)揮多種生物效應(yīng)。目前，有關(guān)VEGF在糖尿病腎臟表達(dá)的變化及其在糖尿病腎病中的作用報(bào)道較少。已有的研究表明，在糖尿病腎病早期，血漿VEGF水平增高；體內(nèi)應(yīng)用VEGF抗體可以改善早期糖尿病腎病引起的腎功能不全；體外實(shí)驗(yàn)表明高糖可刺激培養(yǎng)的腎系膜細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)增多。綜合以上研究結(jié)果，推測(cè)VEGF很可能在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。因此研究糖尿病腎臟VEGF的

3、表達(dá)變化，尋找和發(fā)現(xiàn)調(diào)控腎臟VEGF表達(dá)和功能的藥物，對(duì)闡明糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制和有效的治療方法具有重要意義。 噻唑烷二酮類(lèi)(thiazolidinedine，TZD)是胰島素增敏劑，盡管TZD對(duì)糖尿病腎病治療機(jī)制未完全闡明，研究結(jié)果表明TZD對(duì)糖尿病腎病與ACEI類(lèi)藥物一樣有良好的療效，有關(guān)TZD是否通過(guò)調(diào)控糖尿病腎臟VEGF的表達(dá)，改善腎臟功能，目前鮮有報(bào)道。因此，本研究擬觀察STZ誘導(dǎo)的大鼠糖尿病模型腎臟VEGF的表達(dá)變化，

4、并應(yīng)用TZD類(lèi)藥物羅格列酮(rosiglitazone)進(jìn)行干預(yù)，探討TZD對(duì)糖尿病大鼠腎臟VEGF表達(dá)的調(diào)控和對(duì)糖尿病腎病的治療作用。闡明TZD類(lèi)藥物治療糖尿病腎病的機(jī)制。 方法：健康Wistar雄性大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，隨機(jī)分為普通飲食組(A組)15只，和高脂飲食組，45只，給予高脂飲食喂養(yǎng)2月，按李光偉HOMA指數(shù)判斷出現(xiàn)胰島素抵抗后，腹腔注射STZ(streptozotocin，STZ)造模。將高脂飲食大鼠隨機(jī)分為

5、三組(每組15只)，2型糖尿病未干預(yù)組(B組)，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)；羅格列酮治療組(C組)高脂飼料加羅格列酮；，陽(yáng)性對(duì)照苯那普利治療組(D組)高脂飼料加苯那普利，繼續(xù)喂養(yǎng)1月。所有大鼠實(shí)驗(yàn)期間自由飲水、進(jìn)食。分籠飼養(yǎng)，每籠5只。 每組大鼠均于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始、結(jié)束時(shí)稱(chēng)量體重、取血。大鼠自試驗(yàn)前一日20：00起禁食，試驗(yàn)日8：00分別自?xún)?nèi)眥靜脈采血，分離血清，保存于-20℃，用于各指標(biāo)的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)留取部分腎組織液氮保存，用于測(cè)定VEG

6、FmRNA表達(dá)，部分組織4％戊二醛固定，行電鏡檢測(cè)，其余部分以4％中性多聚甲醛固定，待組織學(xué)檢查。 1血糖、胰島素的測(cè)定。 血糖用葡萄糖氧化酶法測(cè)定；胰島素用放射免疫法測(cè)定。采用穩(wěn)態(tài)模型(HomeoestasisModelAssessment，HOMA)及胰島素敏感指數(shù)(InsulinSensitivityIndex，ISI)評(píng)價(jià)胰島素抵抗的程度。 2血脂的測(cè)定 甘油三脂(triglyceride，TG)

7、、總膽固醇(totalcholesterole，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensitylipoprotein-cholesterole，HDL-C)比色法測(cè)定，低密度脂蛋白膽固醇(lowerdensitylipoprotein-cholesterole，LDL-C)由Friedewald公式(LDL-C=TC-HDL-TG/2.2)求出(以mmol/L計(jì))。Cu+比色法測(cè)定游離脂肪酸(FFAs)含量。 3腎組織VEG

8、FmRNA表達(dá)的測(cè)定 用TrizolKit提取腎組織RNA，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分別擴(kuò)增VEGF和β-actinmRNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳、攝片和計(jì)算機(jī)圖像掃描。RT-PCR產(chǎn)物半定量：因β-actin在組織中均勻表達(dá)，VEGF基因的表達(dá)水平用靶基因與β-actin的比值表示。 4腎臟細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查 常規(guī)方法制備大鼠腎臟光鏡組織切片，行HE及VEGF免疫組化染色。制備電鏡超薄切片，透射電鏡觀察

9、腎臟超微變化。 5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，兩組以上比較采用單因素方差分析和直線相關(guān)分析作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。檢驗(yàn)的顯著性用P值表示。P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異有極顯著性。 結(jié)果： 1對(duì)體重的影響 實(shí)驗(yàn)初，大鼠隨機(jī)分組，各組體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，具有可比性。實(shí)驗(yàn)?zāi)?，模型組體重(396.91±25.49g

10、)明顯高于正常對(duì)照組(340.43±15.72g)，有顯著性差異(P＜0.01)。羅格列酮干預(yù)組(384.87±18.5g)和苯那普利干預(yù)組(380.39±16.3g)體重仍均高于正常對(duì)照組(P＜0.01)，但明顯低于模型組(P＜0.01)。 2對(duì)血糖和胰島素的影響 STZ造模前各組大鼠空腹血糖無(wú)差別。腹腔注射STZ后，模型組血糖(15.68±2.74)明顯高于正常組(5.30±0.47)，有顯著性差異(P＜0.01)。

11、羅格列酮干預(yù)組血糖和苯那普利干預(yù)組的空腹血糖，與正常對(duì)照組相比均有顯著性差異，均明顯低于模型組(P＜0.01)，羅格列酮和苯那普利干預(yù)組血胰島素與正常組相比無(wú)顯著性差異。 3對(duì)血脂的影響 STZ造模后模型組大鼠的(TC)、(TG)、(LDL)、及FFA均明顯升高，與正常組相比有顯著性差異(P＜0.01)。HDL降低，與正常組相比有顯著性差異(P＜0.01)。羅格列酮干預(yù)組的FFA比模型組明顯降低，但仍高于正常組。洛汀新組

12、變化不明顯。 4腎臟病理形態(tài)的改變 光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎小球體積增大、腎小管擴(kuò)張，系膜區(qū)增寬。苯那普利和羅格列酮治療有效抑制腎小球體積的增大。電鏡下腎小球超微結(jié)構(gòu)顯示，模型組大鼠腎小球基底膜厚度較正常對(duì)照組顯著增厚，足細(xì)胞損傷明顯，部分足突融合。羅格列酮干預(yù)組和苯那普利干預(yù)組無(wú)論是基底膜增厚還是足突融合都有非常顯著的改善(P＜0.05)。 5腎組織VEGFmRNA表達(dá)水平的變化 應(yīng)用RT-PCR我

13、們發(fā)現(xiàn)四組大鼠中均有VEGF和β-actinmRNA的表達(dá)。VEGF共有三種亞型，其中VEGF120和VEGF164優(yōu)勢(shì)表達(dá)。在正常對(duì)照組大鼠腎組織VEGFmRNA(0.018±0.008)少量表達(dá)而模型組(0.497±0.063)高表達(dá)，羅格列酮干預(yù)組(0.411±0.029)和苯那普利干預(yù)組(0.411±0.029)比模型組明顯降低，但仍高于正常對(duì)照組。 6免疫組化腎小球VEGF蛋白表達(dá)水平的變化 模型組腎小球VEG

14、F表達(dá)水平(0.301±0.021)較正常對(duì)照組(0.177±0.021)顯著升高(P＜0.05)；羅格列酮干預(yù)組(0.239±0.035)和苯那普利干預(yù)組(0.274±0.027)均明顯低于模型組(P＜0.05)。 結(jié)論： 1長(zhǎng)期高脂飼養(yǎng)并小劑量STZ腹腔注射可成功復(fù)制2型糖尿病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，表現(xiàn)在血糖、血脂增高，胰島素敏感性降低。同時(shí)大鼠腎臟出現(xiàn)糖尿病腎病的病理變化，如腎小球肥大，系膜基質(zhì)增多，腎小球?yàn)V過(guò)膜(基底膜)增厚