羅格列酮對2型糖尿病小鼠肌肉萎縮拮抗機制.pdf

1、目的:了解單純性2型糖尿病(胰島素抵抗)是否會出現(xiàn)肌肉萎縮，探討導(dǎo)致2型糖尿病肌肉萎縮的機制。
　　 方法:
　　 1.動物:采用2型糖尿病基因模型小鼠(BKS.Cg-m+/+Lepr)作為實驗組，同窩出生的野生型小鼠為對照組(C57BLKS/J)，每組12只雄性小鼠，均為出生四周，實驗組和對照組小鼠均購自Jackson Laboratories(Bar Harbor，MEUSA)。對四周大小的實驗

2、組和對照組小鼠進行稱重，然后均以12h亮、12h暗的周期飼養(yǎng)。在另一組試驗中，一組對照組和實驗組均飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料，另一組在對照組和實驗組飼料中均加入馬來酸羅格列酮飼養(yǎng)(8mg/kg/d)。
　　 2.在第9周時再對兩組小鼠進行稱重、測量身長，并采用從心臟采血的方法采集血樣，分別測定實驗組和對照組小鼠的血漿胰島素和血糖。之后將實驗組和對照組小鼠麻醉，取比目魚肌、伸趾長肌、跖肌和心肌進行稱重，并分別測定兩組小鼠肌肉蛋白質(zhì)降解速率、肌動

3、蛋白降解片段、肌纖維橫斷面面積以及蛋白酶體活性。
　　 3.細胞培養(yǎng):將小鼠3T3-L1前脂肪細胞3-10代的細胞置37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間依次采用標(biāo)準(zhǔn)DMEM(CA)培養(yǎng)基，含10％小牛血清(UT)、青霉素(200 U/ml)和鏈霉素(200μg/ml)，培養(yǎng)2天；依次放在含lμM地塞米松，10μg/ml胰島素和0.5mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(Sigma-Aldrich)的誘導(dǎo)分化細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天；放在

4、含10％胰島素的分化后培養(yǎng)基中生長5天，這時細胞形態(tài)上呈現(xiàn)高分化型。之后，細胞再次于DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2天。接下來，將細胞放在含10μg/ml羅格列酮(MI)培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時，然后收集細胞，檢測各項指標(biāo)，包括：脂聯(lián)素mRNA、腫瘤壞死因子a(TNF-a)和白介素6(IL-6)的mRNA表達水平。
　　 4.Real-time PCR用Trizo1RNA提取試劑(Invitrogen)從對照組和實驗組小鼠腓腸肌和不同分化

5、形態(tài)的3T3-L1小鼠細胞提取RNA，進行反轉(zhuǎn)錄后。Real-time PCR用SYBR GreenPCR試劑(Bio-Rad，Hercules，CA)、the Opticon DNA儀器(Bio-Rad)和下面的循環(huán)參數(shù)：94℃2分鐘，94℃15秒40個循環(huán)，55℃30秒，72℃30秒，最后72℃10分鐘。加入引物小鼠泛素連接酶、MuRF-1、甘油醛-3磷酸脫氫酶進行擴增，測定GAPDH基因和檢出值mRNA的表達之間的差異。
　

6、　 5.統(tǒng)計分析:采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，不同處理組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩組之間比較用t檢驗，以P<0.05作為有統(tǒng)計學(xué)意義的判斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果:
　　 1.在實驗第4周時實驗組小鼠體重與對照組小鼠體重沒有明顯差別；但在第9周時實驗組小鼠體重、血糖、血漿胰島素水平與對照組小鼠比較均有明顯增加且差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。二者之間BMI

7、差異有顯著性。
　　 2.在第9周時實驗組小鼠比目魚肌、伸趾長肌、跖肌肌肉重量與對照組相比均有明顯下降且差異具有顯著性意義。
　　 3.實驗組小鼠腓腸肌肌纖維橫切面面積顯著小于對照組且差異具有顯著性意義。
　　 4.實驗組小鼠腓腸肌14-Kda的肌動蛋白片段密度顯著高于對照組。
　　 5.實驗組小鼠比目魚肌、伸趾長肌、跖肌的蛋白質(zhì)降解速率顯著高于對照組。
　　 6.實驗組小鼠腓腸肌中的蛋白體酶活性

8、顯著高于對照組。
　　 7.2型糖尿小鼠磷脂酰肌醇-3激酶(PI3 Knase)活性顯著降低，同時胰島素受體1磷酸化絲氨酸307激酶(pIRS1-ser307)活性顯著升高，Akt磷酸化絲氨酸473(pIRS1-ser473)活性降低，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 8.2型糖尿病小鼠和野生型小鼠均加喂馬來酸羅格列酮飼養(yǎng)35天后，2型糖尿病小鼠血糖、血漿胰島素水平均下降到野生型水平，高血糖癥、高胰島素血癥均得到糾正；

9、但其體重沒有明顯變化。
　　 9.2型糖尿小鼠和野生型小鼠均加喂馬來酸羅格列酮飼養(yǎng)35天后，2型糖尿小鼠與未加喂羅格列酮的2型糖尿小鼠相比：糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)酮的含量顯著降低；二者相比，血漿脂聯(lián)素水平明顯升高。
　　 10.2型糖尿病小鼠和野生型小鼠均加喂馬來酸羅格列酮飼養(yǎng)35天后，PI3K活性增加；IRS-1磷酸化的絲氨酸307(pIRS1-ser307)活性降低、Akt磷酸化的絲氨酸473(pAkt-ser473)活性升

10、高。
　　 11.實驗組和對照組均加喂羅格列酮飼養(yǎng)35天后，加喂羅格列酮飼養(yǎng)35天后的2型糖尿小鼠蛋白酶體活性與未喂加羅格列酮飼養(yǎng)的2型糖尿小鼠相比顯著降低(n=4，t=6.609，P<0.005)；加喂羅格列酮飼養(yǎng)35天后2型糖尿小鼠目魚肌、伸趾長肌、跖肌蛋白質(zhì)分解速率較未加喂羅格列酮均顯著降低((n=4，t=2.461，P<0.05(比目魚肌)；t=4.401，P<0.05(伸趾長肌)；t=2.718，P<0.05(跖肌))

11、。
　　 12.細胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中加羅格列酮后，脂聯(lián)素mRNA表達水平增加，同時腫瘤壞死因子a(TNF-a)和白介素6(IL-6)的mRNA表達水平降低。
　　 13.實驗組和對照組均加喂羅格列酮飼養(yǎng)35天后，加喂羅格列酮飼養(yǎng)后的2型糖尿小鼠蛋白酶體活性磷脂酰肌醇-3激酶活性升高，且有統(tǒng)計學(xué)意義;肌肉中FOXO1轉(zhuǎn)錄因子水平降低、FOXO1轉(zhuǎn)錄因子磷酸化水平升高，肌肉中磷酸化FOXO1轉(zhuǎn)錄因子與FOXO1轉(zhuǎn)錄因子

12、比值升高；肌肉萎縮因子、肌肉環(huán)狀指基因1mRNA表達水平下降。
　　 結(jié)論:
　　 1.2型糖尿病小鼠肌肉蛋白質(zhì)降解增加，存在嚴重的肌肉萎縮。
　　 2.2型糖尿病小鼠泛素-蛋白酶體蛋白質(zhì)水解途徑的被激活，從而使蛋白質(zhì)降解增加，可能是導(dǎo)致肌肉萎縮的機制之一，尚有待進一步深入探討。
　　 3.2型糖尿病小鼠PI3K/Akt細胞通路受損，引起胰島素抵抗，也可能是導(dǎo)致肌肉萎縮的機制之一。
　　 4.羅格