胃酸分泌過程中囊泡定向轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制研究.pdf

1、胞吐是細(xì)胞的一項(xiàng)重要生理活動，它參與了細(xì)胞生長與極化、細(xì)胞通訊、細(xì)胞外被和細(xì)胞外基質(zhì)的形成、受精過程及免疫反應(yīng)等諸多重要生理過程，因而胞吐調(diào)節(jié)機(jī)制受到人們的關(guān)注。對神經(jīng)遞質(zhì)釋放的分子機(jī)制的研究表明：SM(Sec1/Munc18)蛋白通過調(diào)節(jié)可溶性 N - 乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(SNARE)復(fù)合物的組裝達(dá)到調(diào)節(jié)膜融合，進(jìn)而調(diào)節(jié)胞吐的作用。 胃壁細(xì)胞是一種極化的泌酸上皮細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)充滿富含H<'+>，K<'+>-AT

2、Pase的管狀囊泡。在受到內(nèi)分泌、旁分泌及神經(jīng)分泌的刺激時(shí)，激活了cAMP - 依賴的蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而引起管狀囊泡之間的融合(同型融合)及管狀囊泡向頂膜移動，并與頂膜融合(異型融合)，使微絨毛向腺腔內(nèi)急劇伸長，大大增加了頂膜面積，為最大限度地容納質(zhì)子泵奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，原管狀囊泡膜上的H<'+>，K<'+>-ATPase 也隨之轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜，將H<'+>運(yùn)送至胞外并釋放內(nèi)因子(intrinsic factor)。由于胃壁細(xì)胞極化明顯

3、并在激活時(shí)發(fā)生了顯著的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和膜融合反應(yīng)，其形態(tài)學(xué)變化特征有助于生物光子學(xué)研究，同時(shí)還可以較容易地得到生物化學(xué)研究應(yīng)用所需的大量細(xì)胞，因而胃酸分泌過程成為研究cAMP介導(dǎo)的SNARE復(fù)合體組裝及細(xì)胞骨架動力學(xué)的極佳模式系統(tǒng)。 在調(diào)節(jié)壁細(xì)胞分泌的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，發(fā)現(xiàn) CDK5和Munc18b是壁細(xì)胞內(nèi)cAMP - 依賴的胃酸分泌過程所必需的蛋白。體外的生化實(shí)驗(yàn)顯示Munc18b N- 端156個氨基酸序列可與 syn

4、taxin(Stx)的四個同源物Stxs 1-4 以相同強(qiáng)度結(jié)合，而C-端的54個氨基酸序列特異性地與Stx3結(jié)合；特別是當(dāng)Munc18b的 Thr 572被CDK5磷酸化后，Munc18b-Stx3的相互作用大大降低了，但同時(shí)卻促進(jìn)了Munc18b-Stx3-SNAP25三元復(fù)合物的形成，進(jìn)而導(dǎo)致了功能性的Munc18b-Stx3-SNAP25-VAMP2膜融合機(jī)器的組裝：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明CDK5是介導(dǎo)的Munc18b磷酸化是SNARE

5、復(fù)合物形成所必需的。據(jù)此，我們提出了調(diào)節(jié)性胞吐中一個新的膜融合調(diào)節(jié)機(jī)制：CDK5磷酸化Munc18b調(diào)節(jié)了SNARE復(fù)合物的形成，進(jìn)而調(diào)控了囊泡停泊與融合。 Ezrin是連接細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架的ERM蛋白家族的一員，它含有兩個很重要的結(jié)構(gòu)域N-ERMAD和C-ERMAD，通常情況下，ezrin的N-ERMAD結(jié)構(gòu)域被自身或其它分子的C-ERMAD結(jié)構(gòu)域所結(jié)合而處于失活狀態(tài)。Ezrin參與了上皮細(xì)胞的極化、質(zhì)膜蛋白的定位及功能的調(diào)

6、節(jié)，在壁細(xì)胞中主要定位于頂膜囊泡，參與了管狀囊泡向頂膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，但其機(jī)制目前仍不清楚。由于Stx3是一種定位在上皮細(xì)胞頂膜的整合膜蛋白，參與了囊泡與頂膜的融合及上皮細(xì)胞的極化，因此推測Stx3和Ezrin之間可能存在某種相互作用，共同促進(jìn)了壁細(xì)胞激活時(shí)管狀囊泡向頂膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。體外生化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Stx3與ezrin存在相互作用，并進(jìn)一步Map出Stx3的Habc結(jié)構(gòu)域和ezrin的N- 端N-ERMAD結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了Stx3-ezrin相互作用

7、。這種相互作用受到了ezrin的磷酸化狀態(tài)的調(diào)節(jié)：Stx3特異性地與模擬Ser 66磷酸化的ezrin<'S66D>相互作用，而不與野生型ezrin<'wt>結(jié)合，提示Ser66磷酸化可能改變了Ezrin分子N端的構(gòu)象。利用原子力顯微鏡，對Ezrin進(jìn)行了單分子形態(tài)研究，我們的結(jié)果揭示：Ser66磷酸化開啟了Ezrin分子，使整個分子更為伸展，從而使Stx3-ezrin復(fù)合物形成。研究說明了壁細(xì)胞酸分泌過程中Ezrin調(diào)控管狀囊泡定向轉(zhuǎn)