Munc13-1 MUN結(jié)構(gòu)域在突觸囊泡啟動(dòng)過(guò)程中的作用機(jī)制研究.pdf

1、突觸囊泡的分泌過(guò)程以SNARE蛋白syntaxin-1，SNAP-25，synaptobrevin組裝成致密的四螺旋結(jié)構(gòu)復(fù)合物為核心機(jī)制，同時(shí)受到Munc18-1以及Munc13-1等多種蛋白的嚴(yán)格調(diào)控。本課題綜合運(yùn)用X-射線(xiàn)晶體學(xué)、生物化學(xué)以及體外膜重建、電生理等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，深入研究了Munc13-1重要功能片段MUN結(jié)構(gòu)域調(diào)控突觸囊泡分泌啟動(dòng)過(guò)程的功能機(jī)制，結(jié)果如下：
　　獲得了大鼠Munc13-1MUN結(jié)構(gòu)域三維晶體結(jié)構(gòu)。設(shè)計(jì)

2、Munc13-1MUN結(jié)構(gòu)域包括A、B、C、D全部四個(gè)亞結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)片段MUN933，并獲得MUN933分辨率為2.9的晶體結(jié)構(gòu)。MUN結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)呈一系列α-螺旋束排列形成的狹長(zhǎng)拱形，其中部亞結(jié)構(gòu)域B同C接合處存在一個(gè)高度保守的疏水口袋。
　　鑒定了大鼠Munc13-1MUN結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)syntaxin-1打開(kāi)作用的關(guān)鍵活性位點(diǎn)。在以Munc18-1–syntaxin-1復(fù)合物起始的SNARE復(fù)合物組裝以及SNARE復(fù)合物組裝介導(dǎo)的

3、體外膜融合體系中，位于疏水口袋的高度保守氨基酸Asn1128、Phe1131（NF）突變后導(dǎo)致Munc13-1MUN結(jié)構(gòu)域失去催化打開(kāi)Munc18-1–syntaxin-1復(fù)合物的活性。
　　證明了UNC-13-Munc13MUN結(jié)構(gòu)域關(guān)鍵活性位點(diǎn)在突觸囊泡啟動(dòng)過(guò)程中的重要調(diào)控作用。在成年秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)體壁肌肉的神經(jīng)肌肉連接頭（NMJs）處記錄興奮性突觸后電流（EPSC），MUN結(jié)構(gòu)域NF位點(diǎn)對(duì)于自發(fā)和誘發(fā)性釋放至關(guān)重要，突變后導(dǎo)致

4、NMJs突觸囊泡無(wú)法啟動(dòng)。
　　此前，UNC-13-Munc13MUN結(jié)構(gòu)域是神經(jīng)遞質(zhì)釋放過(guò)程中唯一缺少三維結(jié)構(gòu)的基本要素，本課題獲得并解析出的大鼠Munc13-1蛋白完整且具活性的MUN結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)填補(bǔ)了這一空白，為UNC-13-Munc13s在突觸囊泡分泌過(guò)程中的作用機(jī)制研究提供結(jié)構(gòu)依據(jù)。發(fā)現(xiàn)UNC-13-Munc13MUN結(jié)構(gòu)域催化打開(kāi)syntaxin-1同時(shí)促進(jìn)SNARE復(fù)合物組裝介導(dǎo)的膜融合的關(guān)鍵活性位點(diǎn)，并證明該活性