難治性癲癇突觸囊泡功能相關蛋白初步研究.pdf

1、目的：檢測耐苯妥英鈉杏仁核點燃大鼠腦組織突觸囊泡功能相關蛋白差異表達基因、與突觸囊泡回收相關的蛋白表達，以探討難治性癲癇突觸功能的改變，進一步完善人類對難治性癲癇的認識。 方法：建立耐苯妥英鈉杏仁核點燃大鼠(難治性癲癇鼠／耐PHT組/I組)和苯妥英鈉有效杏仁核點燃大鼠(非難治性癲癇鼠/PHT有效組/P組)模型，抽提兩者腦組織的RNA，并純化mRNA，分別逆轉錄合成熒光分子摻入的cDNA-鏈做探針；將含有4096條人類基因PCR產(chǎn)

2、物按微矩陣點樣于化學涂層的栽玻片上，制成基因芯片，芯片雜交和洗片后，用ScanArray300O熒光掃描儀掃描芯片熒光信號圖象，利用計算機分析耐PHT組和PHT有效組大鼠腦組織差異表達的突觸囊泡功能相關蛋白基因；篩選出部分與突觸囊泡循環(huán)回收相關的蛋白差異表達基因，運用蛋白印跡法、免疫組化法在蛋白水平進一步進行驗證。 結果：在4096條基因中，耐PHT組和PHT有效組大鼠腦組織間存在明顯差異表達的基因共364條，與突觸囊泡功能相關

3、蛋白差異表達基因18條，上調的有14條，下調的有4條，其中與突觸囊泡循環(huán)再生密切相關的網(wǎng)格蛋(clathrin)、突觸囊泡膜蛋白I(syn印totagminI)基因表達增強，而熱休克同源蛋白Hsc70假基因表達降低；運用蛋白印跡、免疫組化對這3種蛋白產(chǎn)物進一步驗證顯示在難治性癲癇鼠腦組織與突觸囊泡循環(huán)再生密切相關的網(wǎng)格蛋白、突觸囊泡膜蛋白I表達增強，熱休克同源蛋白Hsc70表達降低(P

4、在突觸囊泡功能相關蛋白、基因差異表達，其中與突觸囊泡循環(huán)再生密切相關的網(wǎng)格蛋白、突觸囊泡膜蛋白I表達增強，熱休克同源蛋白Hsc70表達降低，提示難治性癲癇鼠腦組織可能存在突觸囊泡功能及循環(huán)再生的改變，這些改變在難治性癲癇的發(fā)病及維持中可能起一定的作用。 目的：在動物實驗陽性結果的基礎上進一步檢測難治性癲癇病人腦組織突觸囊泡功能相關蛋白、基因的差異表達，以探討人類難治性癲癇突觸功能的改變，進一步完善對人類難治性癲癇的認識。

5、 方法：收集難治性癲癇病人和正常人腦組織標本，抽提兩者腦組織的RNA，并純化mRNA，分別逆轉錄合成熒光分子摻入的cDNA-鏈做探針；將含有4096條人類基因PCR產(chǎn)物按微矩陣點樣于化學涂層的栽玻片上，制成基因芯片，芯片雜交和洗片后，用ScanArray4000熒光掃描儀掃描芯片熒光信號圖象，利用計算機分析難治性癲癇病人和正常對照組腦組織差異表達的突觸囊泡功能相關蛋白基因；篩選出部分突觸囊泡循環(huán)回收相關蛋白差異表達基因，運用RT-PCR

6、、免疫組化在mRNA及蛋白水平進一步進行驗證。 結果：在4096條基因中，難治性癲癇和正常對照組腦組織間存在明顯差異表達的基因451條，與突觸囊泡功能相關蛋白差異表達基因14條，上調的有l(wèi)O條，下調的有4條，其中與突觸囊泡循環(huán)再生相關的網(wǎng)格蛋白(clathrin)、突觸囊泡膜蛋白16(synaptotagmin16)等表達增強；運用IT-PCR在mRNA水平進一步證實網(wǎng)格蛋白、突觸囊泡膜蛋白16表達增強，運用免疫組化對網(wǎng)格蛋白、

7、突觸囊泡膜蛋白I的蛋白產(chǎn)物驗證顯示在難治性癲癇腦組織與突觸囊泡循環(huán)再生相關的網(wǎng)格蛋白、突觸囊泡膜蛋白I表達增強(P