寧癇顆粒聯(lián)合卡馬西平對(duì)難治性癲癇大鼠的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　本研究通過建立海人酸難治性癲癇大鼠模型，采用寧癇顆粒、卡馬西平單獨(dú)或聯(lián)合治療，觀察海人酸難治性癲癇大鼠行為學(xué)和腦電圖變化，從炎癥因子、凋亡及耐藥基因探討寧癇顆?？拱d癇作用機(jī)制，為中西醫(yī)結(jié)合治療難治性癲癇提供了新的治療方法。
　　方法：
　　第一部分：采用海人酸海馬CA3區(qū)微量注射的化學(xué)點(diǎn)燃方法制作模型，通過苯妥英鈉及腦電圖篩選成功制作慢性難治性癲癇模型36只，隨機(jī)分為模型組、卡馬西平組、寧癇顆粒組、寧癇顆粒

2、低、中、高劑量聯(lián)合卡馬西平組，再加假手術(shù)組，共7組，每組6只。
　　第二部分：觀察各組大鼠治療前后體重、癲癇發(fā)作的次數(shù)、發(fā)作平均持續(xù)時(shí)間、被抓時(shí)平均防衛(wèi)級(jí)別、發(fā)作級(jí)別、SRS發(fā)作總時(shí)間，并對(duì)各組大鼠治療前后進(jìn)行腦電圖監(jiān)測(cè)。
　　第三部分：難治性癲癇大鼠模型每組6只，分組治療后與假手術(shù)組6只，予心尖灌注生理鹽水后取腦，在4％多聚甲醛中固定，常規(guī)制備石蠟切片（含皮層和海馬）。HE染色觀察海馬各區(qū)及顳葉皮層神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，免

3、疫組化觀察海馬及顳葉皮層c-fos、caspase-3的表達(dá)。
　　第四部分：按上述治療分組后股動(dòng)脈采血，收集各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清采用免疫酶聯(lián)法(Elisa法)測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平。
　　第五部分：按上述治療分組后大鼠在10%水合氯醛麻醉下取腦，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組大鼠腦內(nèi)海馬MDR1mRNA表達(dá)，western-blot法檢測(cè)其相應(yīng)P-gp表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　第一部分

4、：采用海馬局部注射海人酸及藥物篩選后成功制作成難治性癲癇大鼠模型。
　　第二部分：治療后大鼠體重比較：與卡馬西平組比較，寧癇顆粒中、高劑量聯(lián)合卡馬西平組體重明顯增加，有顯著性差異（P<0.05）；大鼠治療前后發(fā)作平均持續(xù)時(shí)間比較：與卡馬西平組比較，寧癇顆粒中、高劑量聯(lián)合卡馬西平發(fā)作平均持續(xù)時(shí)間明顯減少，有極顯著性差異（P<0.01）；大鼠治療前后被抓時(shí)的平均防衛(wèi)反應(yīng)評(píng)分：與卡馬西平組比較，寧癇顆粒中、高劑量聯(lián)合卡馬西平組被抓時(shí)平均

5、防衛(wèi)反應(yīng)評(píng)分明顯減少，有極顯著性差異（P<0.01）；大鼠治療前后平均發(fā)作級(jí)別的變化：與卡馬西平組比較，寧癇顆粒中、高劑量聯(lián)合卡馬西平組平均發(fā)作級(jí)別減少，有極顯著性差異（P<0.01）；SRS發(fā)作總時(shí)間變化：與卡馬西平組比較，寧癇顆粒中、高劑量聯(lián)合卡馬西平組SRS發(fā)作總時(shí)間明顯減少，有極顯著性差異（P<0.01）。腦電圖顯示寧癇顆粒中、高劑量聯(lián)合卡馬西平組大鼠癇性放電受到抑制。
　　第三部分：c-fos表達(dá)：假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)組織

6、切片中可見少量c-fos陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，模型組海馬區(qū)c-fos陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)明顯增多。與卡馬西平組比較，寧癇顆粒低、中、高劑量組聯(lián)合卡馬西表達(dá)明顯減少，有極顯著性差異（P<0.01）；caspase-3表達(dá)：與卡馬西平組比較，寧癇顆粒低、中、高劑量聯(lián)合卡馬西組表達(dá)減少，有顯著性差異（P<0.05）。
　　第四部分：IL-1β表達(dá)：與卡馬西平組比較，寧癇顆粒低劑量聯(lián)合卡馬西平組大鼠血清IL-1β含量顯著降低(P<0.05)，寧癇顆粒中

7、、高劑量組聯(lián)合卡馬西平大鼠血清IL-6含量極顯著降低(P<0.01)；IL-6表達(dá)：與卡馬西平組比較，寧癇顆粒低劑量聯(lián)合卡馬西平組大鼠血清IL-6含量顯著降低(P<0.05)；寧癇顆粒中、高劑量聯(lián)合卡馬西平組大鼠血清IL-6含量極顯著降低(P<0.01)；TNF-α表達(dá)：與卡馬西平組比較，寧癇顆粒低、中、高劑量聯(lián)合卡馬西平組大鼠血清TNF-α含量極顯著降低(P<0.01)。
　　第五部分：MDR1mRNA表達(dá)：與模型組比較，其余各

8、組大鼠腦組織MDR1含量極顯著降低(P<0.01)；與卡馬西平組比較，寧癇顆粒中、高劑量聯(lián)合卡馬西平組大鼠腦組織MDR1含量極顯著降低(P<0.01)；P-gp表達(dá)：與模型組比較，寧癇顆粒高劑量聯(lián)合卡馬西平組大鼠腦組織P-gp蛋白表達(dá)極顯著降低(P<0.01)，寧癇顆粒低、中劑量聯(lián)合卡馬西平組表達(dá)顯著降低(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.本研究成功建立了大鼠海馬局部注射微量海人酸后經(jīng)癲癇持續(xù)狀態(tài)及藥物篩選成為難治性癲癇

9、模型，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，成功率高，節(jié)約成本，為后續(xù)研究打下較好的基礎(chǔ)。
　　2.寧癇顆粒低、中、高劑量聯(lián)合卡馬西平組能明顯減少各組致癇大鼠的癇性發(fā)作平均持續(xù)時(shí)間、被抓時(shí)的防衛(wèi)反應(yīng)評(píng)分、SRS發(fā)作總時(shí)間，并降低癇性發(fā)作程度，比單用中藥或西藥有明顯改善。腦電圖顯示寧癇顆粒中、高劑量組聯(lián)合卡馬西平組大鼠癇性放電明顯受到抑制，只見少量棘波或尖波，而以寧癇顆粒高劑量聯(lián)合卡馬西平組出現(xiàn)最少。
　　3.寧癇顆粒低、中、高劑量聯(lián)合卡馬西平組可以

10、明顯降低c-fos、caspase-3基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用；推測(cè)寧癇顆?？赡茏饔糜诩?xì)胞凋亡途徑的多個(gè)靶點(diǎn)，與卡馬西平有協(xié)同增效的作用，但凋亡基因的表達(dá)并未隨中藥劑量的增加而下調(diào)。
　　4.IL-1β、IL-6、TNF-α共同參與了免疫反應(yīng)，其水平的變化間接反映了腦組織損傷程度。寧癇顆粒中、高劑量聯(lián)合卡馬西平組炎癥因子的表達(dá)明顯低于卡馬西平組（P<0.01），表明寧癇顆粒聯(lián)合卡馬西平具有一定的免疫抑制作用