Dynamin蛋白在內(nèi)毛細(xì)胞突觸囊泡內(nèi)吞作用及其與聽(tīng)力的關(guān)系.pdf

1、研究背景:
　　目前聽(tīng)力障礙被認(rèn)為是發(fā)達(dá)國(guó)家最普遍的殘疾，而感音神經(jīng)性耳聾患者占了其中大部分的比例，所以研究感音神經(jīng)性耳聾的發(fā)病機(jī)制對(duì)疾病的防治至關(guān)重要。聽(tīng)覺(jué)信號(hào)從外周傳入聽(tīng)覺(jué)中樞需要耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞突觸釋放興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，引起突觸后膜產(chǎn)生動(dòng)作電位，實(shí)現(xiàn)聽(tīng)信號(hào)由機(jī)械信號(hào)-化學(xué)信號(hào)-電信號(hào)的轉(zhuǎn)化，再逐級(jí)傳入中樞形成聽(tīng)力。內(nèi)毛細(xì)胞突觸間神經(jīng)遞質(zhì)持續(xù)、有效的釋放需要一個(gè)高效的囊泡回收機(jī)制。科學(xué)研究證明，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(CME)是囊泡

2、回收的主要途徑，對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，Dynamin在內(nèi)吞過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。Dynamin的具體作用是其在網(wǎng)格蛋白包裹的內(nèi)陷囊泡頸部聚集形成螺旋狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)水解GTP調(diào)節(jié)自身收縮，將囊泡與質(zhì)膜分離開(kāi)。研究表明，Dynamin缺失會(huì)引起CME功能缺陷，突觸囊泡數(shù)量減少，導(dǎo)致釋放神經(jīng)遞質(zhì)的能力大大減弱。Dynamin敲除小鼠會(huì)出現(xiàn)視力障礙，而對(duì)于Dynamin在內(nèi)耳毛細(xì)胞中的分布情況、作用機(jī)制及其對(duì)聽(tīng)力的影響，目前研

3、究較少。
　　本課題從Dynamin各亞型在內(nèi)毛細(xì)胞的表達(dá)定位情況入手，分析Dynamin各亞型在不同年齡小鼠內(nèi)毛細(xì)胞表達(dá)模式的差異及其與聽(tīng)力變化的相關(guān)性。利用目前檢測(cè)突觸囊泡功能的電生理膜片鉗實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)Dynamin在內(nèi)毛細(xì)胞中是如何調(diào)控突觸囊泡內(nèi)吞作用的，通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，從形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)及生理學(xué)等方面了解Dynamin，明確其在內(nèi)毛細(xì)胞網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞過(guò)程中的可能作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　

4、　1、取正常成年昆明小鼠耳蝸基底膜行免疫熒光染色，對(duì)Dynamin各亞型在小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞進(jìn)行初步表達(dá)定位，明確Dynamin各亞型在耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞中有表達(dá);
　　2、明確蛋白有表達(dá)后，分別取出生后2周、10周、16月齡的昆明小鼠，依次分為幼年組、成年組、老年組，測(cè)定各組聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)閾值，評(píng)估小鼠聽(tīng)力變化;
　　3、采用免疫熒光法觀察各年齡階段小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞Dynamin亞型的表達(dá)情況、及細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，探討蛋白表

5、達(dá)情況與年齡及聽(tīng)力的相關(guān)性;
　　4、采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)不同年齡段Dynamin各亞型mRNA表達(dá)情況，檢測(cè)不同年齡對(duì)Dynamin表達(dá)的影響，進(jìn)而探討其與聽(tīng)力的相關(guān)性;
　　5、采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)初步探查阻斷Dynamin后內(nèi)毛細(xì)胞膜電容變化情況，了解其在突觸囊泡內(nèi)吞過(guò)程中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、正常成年小鼠Dynamin各亞型在耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞中均有表達(dá)。其中，Dynamin

6、-1表達(dá)于整個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞，Dynamin-2分布在內(nèi)毛細(xì)胞核周?chē)安糠职|(zhì)，Dynamin-3散在高表達(dá)于內(nèi)毛細(xì)胞核下方靠近螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域。
　　2、各年齡組所測(cè)得ABR閾值分析得出，小鼠隨年齡增大閾值逐漸增高，成年組與幼年組ABR平均閾值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，老年組存在明顯的聽(tīng)力下降，分別與成年組、幼年組相比聽(tīng)力存在明顯差異(P＜0.05)。
　　3、比較不同年齡組Dynamin不同亞型熒光染色圖像后發(fā)現(xiàn)，幼年組與成年組Dyna

7、min-1、Dynamin-2分布于內(nèi)細(xì)胞質(zhì)，老年組Dynamin-1在細(xì)胞核下部分域存在缺失，Dynamin-2則僅僅表達(dá)于內(nèi)毛細(xì)胞核周?chē)?。三個(gè)年齡組Dynamin-3的定位無(wú)差別，均散在定位于內(nèi)毛細(xì)胞核下基底部，靠近螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域，老年組染色較幼年、成年更稀疏、表達(dá)更少。
　　4、小同年齡組各亞型mRNA表達(dá)水平顯示，與幼年組相比，Dynamin-1表達(dá)量隨年齡增加逐漸減少(P＜0.05)，Dynamin-2在成年表達(dá)量至高峰

8、，之后逐漸減少。Dynamin-3的表達(dá)情況未能檢測(cè)出。
　　5、在用Dyngo-4a抑制Dynamin的作用后，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞△Cm增大，由于數(shù)據(jù)較少，暫不能完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)論:
　　Dynamin各亞型在小鼠內(nèi)毛細(xì)胞均有表達(dá)定位，Dynamin-1、Dynamin-2隨著年齡的增加表達(dá)量有所改變。內(nèi)耳毛細(xì)胞存在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(CME)，并且Dynamin在其中扮演重要角色。Dy

9、namin的不同亞型在不同年齡階段對(duì)CME交替發(fā)揮著作用，即Dynamin-1主要在幼年時(shí)期發(fā)揮主要作用，到成年階段Dynamin-2可能取代了Dynamin-1的作用影響著CME過(guò)程。由此推測(cè)Dynamin-2可能參與整個(gè)聽(tīng)力的發(fā)展過(guò)程，尤其在成年時(shí)期，而Dynamin-1對(duì)幼年時(shí)期的聽(tīng)力起到了一定作用，我們認(rèn)為Dynamin-3在內(nèi)毛細(xì)胞CME或聽(tīng)力形成中起到的作用尚不明確。全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄Dynamin的作用被抑制后，囊泡內(nèi)吞