細(xì)胞表面新型微囊泡的分離及其特性研究.pdf

1、細(xì)胞表面微囊泡是貼壁細(xì)胞鋪展后存在于細(xì)胞表面的與細(xì)胞質(zhì)膜綁定的半球狀突起，直徑約為1um。目前，僅依據(jù)尺寸的相似性，有少量報(bào)道把這種細(xì)胞表面微囊泡當(dāng)作釋放型細(xì)胞外微顆粒的前體來看待，既缺乏直接的證據(jù)表明兩者的相關(guān)性，也因缺乏有效的分離純化方法無法對細(xì)胞表面微囊泡的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行深入研究。因此，非常有必要提供直接證據(jù)鑒定細(xì)胞表面微囊泡是屬于細(xì)胞外微顆粒的前體還是一種具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)和生理功能的新型微囊泡；也非常有必要建立一種分離、純化細(xì)胞表面

2、微囊泡的有效方法，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)和功能研究打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　本課題以臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC和人肝癌細(xì)胞系HepG-2兩種貼壁細(xì)胞為細(xì)胞模型來研究細(xì)胞表面微囊泡。通過共聚焦顯微鏡和掃描電鏡觀察首先確定了這種微囊泡是存在于細(xì)胞表面，通過特異標(biāo)志物的免疫熒光染色也排除了這種微囊泡是細(xì)胞質(zhì)中線粒體和多泡小體等細(xì)胞器頂起所致的可能性；隨后，通過已被廣泛認(rèn)可的特異性標(biāo)志物（CD31、CD146、CD63和PS等）的免疫熒光染色，證明這種微

3、囊泡不屬于細(xì)胞外微顆粒、外泌小泡和凋亡小體；實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，這種微囊泡能夠被70％以上濃度的乙醇和氯仿甲醇溶解，但能被脂質(zhì)固定試劑鋨酸所保護(hù)，說明這種微囊泡是具有脂質(zhì)成分的結(jié)構(gòu)；免疫熒光實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，這種微囊泡表面可能含有FAK、GM1、GM3或小窩蛋白-1等分子，但不是其所特有；進(jìn)一步強(qiáng)烈證據(jù)表面，細(xì)胞表面微囊泡對Triton X-100、SDS和saponin等去垢劑具有極強(qiáng)的抗性，是這種微囊泡具有的獨(dú)特物化性質(zhì)之一；最后，通過大量的探索

4、研究，利用其獨(dú)特的物化性質(zhì)本課題實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞表面微囊泡的有效分離，為該膜結(jié)構(gòu)的分子特性研究和組分分析提供了可能。
　　本課題提供了堅(jiān)實(shí)、可靠的證據(jù)，證明細(xì)胞表面微囊泡既不是細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器（如線粒體和多泡小體等）頂起所致、也不是細(xì)胞外囊泡（如細(xì)胞外微顆粒、外泌小泡和凋亡小體等）的前體，而是一種位于細(xì)胞表面、具有脂質(zhì)成分和獨(dú)特物化性質(zhì)的新型微囊泡；更為重要的是，本課題首次建立了一種分離細(xì)胞表面微囊泡的簡單、有效的分離方法，為其組分、結(jié)構(gòu)和