外周血造血干細胞來源微泡的生物學特性.pdf

1、造血干細胞（hematopoietic stem cells）是一類異質(zhì)性的、具有自我更新和多向血細胞分化潛能的成體干細胞。根據(jù)來源不同，其可分類為骨髓造血干細胞，臍血造血干細胞,胎肝造血干細胞和外周血造血干細胞。因外周血造血干細胞（PB-HSC）具有采集方法簡便，短期內(nèi)可重復(fù)采集，受者輸注后造血、免疫功能重建快，且植入率高等優(yōu)點，在移植和細胞免疫治療方面發(fā)揮日益重要的作用。
　　微泡(MV)是細胞分泌的亞微米雙層膜結(jié)構(gòu)，包括從內(nèi)

2、涵體分泌的外泌體，以及從絕大多數(shù)細胞膜表面分泌的微粒。其含有母體細胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA以及microRNA等成分，通過與其它細胞融合，將其內(nèi)容物釋放到靶細胞，影響其功能，從而在不同細胞間信息傳遞過程中發(fā)揮重要作用。微泡可由多種細胞分泌，并廣泛分布于血漿、唾液、乳汁、汗液等各種體液中。不僅正常細胞可分泌微泡，腫瘤細胞也可以分泌微泡：在腫瘤病人的體液中可以檢測到微泡。因此在生理和病理狀態(tài)下,不同細胞分泌的微泡是一個混合的群體。微泡隨著

3、細胞的來源、數(shù)量、大小和抗原成分的變化而不同。
　　外周血造血干細胞具有免疫調(diào)節(jié)，促進造血恢復(fù)等作用。因為微泡帶有母體細胞的信息，所以我們推斷外周干來源的微泡可能也具有同樣的功能。而且研究表明，微泡沒有或者具有很小的免疫原性，如果其具有一定的功能，可具有廣泛的臨床應(yīng)用。但是，目前對外周血造血干細胞來源的微泡研究甚少。本研究旨在對外周血造血干細胞來源的微泡進行生物學特性探究，尤其對其免疫調(diào)節(jié)和促造血功能加以探索。
　　研究目的

4、提取并鑒定正常人外周血造血干細胞來源的微泡，并研究其生物學特性：包括探究正常人外周血造血干細胞來源的微泡的免疫調(diào)節(jié)功能及對造血集落形成的影響。
　　研究內(nèi)容將正常人外周血造血干細胞提取并培養(yǎng)，從培養(yǎng)上清中提取出外周血造血干細胞來源的微泡并鑒定，研究其生物學特性：探究正常人外周血造血干細胞來源的微泡對外周血單個核細胞是否具有免疫調(diào)節(jié)功能？及正常人外周血造血干細胞來源的微泡是否對造血集落形成有影響？
　　研究方法:
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5、1）利用密度梯度離心法分離正常人動員后外周血造血干細胞，收集培養(yǎng)第48小時上清液，超速離心法分離提取微泡;
　?。?）通過電子顯微鏡觀察微泡形態(tài)；采用bicinchoninic acid(BCA)法標定微泡數(shù)量；采用流式細胞儀檢測其表面標志物；
　?。?）將微泡與正常人外周血單個核細胞(PB-MNC）共培養(yǎng)12h后，通過共聚焦掃描電鏡觀察微泡與單個核細胞的作用方式；共培養(yǎng)48h后采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA）法檢測上清

6、中IL-2,IL-6,IL-8,IL-10,IFN-γ及TNF-α的分泌量；共培養(yǎng)48h后采用流式細胞儀檢測T細胞亞群及T細胞激活變化；共培養(yǎng)48h后采用流式細胞儀檢測不同亞群細胞胞內(nèi)細胞因子染色情況；
　　（4）采用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基檢測微泡及微泡與單個核細胞共培養(yǎng)48小時后上清液對外周血造血干細胞集落形成的影響。
　　研究結(jié)果:通過密度梯度離心法可提取出動員后外周血造血干細胞。利用超速離心法可成功提取出外周血造血干細

7、胞來源的微泡。透射電子顯微鏡觀察分離得到的微泡為卵圓形膜性小囊泡。流式細胞術(shù)測得微泡高表達其特異性標志CD63(85.86％),并帶有其母體細胞標志如干細胞標志CD34(33.52%)，T細胞標志CD3(43.98%)、CD45RA(23.54%)、CD45RO(68.3%)，NK細胞標志CD56(32.32%)等。共聚焦掃描電鏡顯示微泡可以與外周血單個核細胞相融合并促進其分泌IL-6,IL-8，IL-10與TNF-α細胞因子。流式細胞