羊水來源干細(xì)胞的生物學(xué)特性分析及其向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、羊水來源干細(xì)胞(amniotic fluid—derived stem cells，AFSCs)是近幾年來倍受關(guān)注的新成體干細(xì)胞類型，有關(guān)羊水干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、生物學(xué)特性分析、體內(nèi)外分化潛能等仍有很多問題需深入探討。在其誘導(dǎo)分化方向和應(yīng)用領(lǐng)域方面，我們針對(duì)我國(guó)肝病的發(fā)病形式和目前肝臟再生修復(fù)治療的限制性因素，以分離、培養(yǎng)和鑒定羊水來源干細(xì)胞、并將其在體內(nèi)外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞為目標(biāo)，建立相應(yīng)的技術(shù)方法，為人類羊水來源干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)

2、用奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究主要包括三部分：
　　 一、AFSCs分離培養(yǎng)方法的建立及生物學(xué)特性分析：
　　 孕中期羊水(10-20ml)離心后細(xì)胞沉淀分別在下列四種不同條件下進(jìn)行培養(yǎng)：低糖DMEM培養(yǎng)基(LD)+10％胎牛血清(FBs)、LD+20％胎牛血清、LD+15％胎牛血清+4ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、LD+10％胎牛血清+0.1％明膠鋪板。比較不同培養(yǎng)條件下原代集落數(shù)、可傳代次數(shù)、擴(kuò)增

3、細(xì)胞數(shù)等；選擇最佳條件對(duì)羊水來源干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，通過形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞周期和生長(zhǎng)曲線、特異性標(biāo)志物檢測(cè)、體外誘導(dǎo)分化、染色體核型分析及致瘤實(shí)驗(yàn)等對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行系統(tǒng)分析。
　　 結(jié)果：15％血清結(jié)合bFGF可促進(jìn)原代羊水細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)和持續(xù)擴(kuò)增，在此培養(yǎng)條件下AFSCs生長(zhǎng)旺盛，持續(xù)傳代；表達(dá)大部分間充質(zhì)來源標(biāo)志如C0105、CD44、CD29，以及部分全能干細(xì)胞標(biāo)志如SSES-4、Oct-4和Nanog；經(jīng)不同誘導(dǎo)分化條件培養(yǎng)

4、后，從基因表達(dá)或表型上證實(shí)可向脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元及成骨細(xì)胞等不同胚層的目的細(xì)胞分化；長(zhǎng)期培養(yǎng)中染色體核型穩(wěn)定，注射裸鼠體內(nèi)后8周未見腫瘤形成。
　　 二、AFSCs向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　 根據(jù)AFSCs的生物學(xué)特點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了三階段AFSCs向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化的策略：二甲基亞砜(DMSO)及表皮生長(zhǎng)因子預(yù)處理2天一序貫加入成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4(FGF4)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)誘導(dǎo)分化10天-HGF、制瘤素(

5、0SM)、地塞米松、ITS聯(lián)合繼續(xù)促進(jìn)成熟10＋天。分別從細(xì)胞形態(tài)、肝細(xì)胞特定基因表達(dá)及肝細(xì)胞特殊功能檢測(cè)等方面對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　 結(jié)果：誘導(dǎo)后AFSCs形態(tài)由梭形或長(zhǎng)梭形逐漸向圓形或多角形轉(zhuǎn)化，RT-PCR可檢測(cè)到AFP、Alb、CK18、HNF4β、CYPB1等肝細(xì)胞特異基因的表達(dá)；免疫熒光法檢測(cè)到胞漿內(nèi)AFP及白蛋白的表達(dá)。誘導(dǎo)后的細(xì)胞能夠攝取，排出靛青綠、貯存糖原、分泌白蛋白。表明AFSCs體外在一定條件下具有

6、分化為有功能肝細(xì)胞的能力。
　　 三、AFSCs向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化的體內(nèi)研究
　　 以四氯化碳(CCL4)腹腔注射造成裸鼠急性肝損傷模型，尾靜脈注入以熒光染料CFDA-SE標(biāo)記的未誘導(dǎo)AFSCs。分別于移植后3天、10天、20天處死部分裸鼠，留取肝臟和血液標(biāo)本，檢測(cè)裸鼠肝臟內(nèi)是否有標(biāo)記細(xì)胞分布；同時(shí)觀察細(xì)胞移植組及對(duì)照組肝臟病理及肝功能指標(biāo)變化。
　　 結(jié)果：移植后3天、10天、20天，裸鼠肝臟內(nèi)均有一定比例的標(biāo)記

7、細(xì)胞，移植后10天標(biāo)記細(xì)胞同時(shí)表達(dá)出成熟肝細(xì)胞標(biāo)志-白蛋白，提示移植細(xì)胞已整合到裸鼠肝臟并分化為肝細(xì)胞；HE染色顯示移植AFSCs的裸鼠肝臟損傷愈合過程加快，移植后10天組織學(xué)觀察基本恢復(fù)正常；而對(duì)照組在移植后20天仍有明顯的壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)灶。
　　 結(jié)論：本文成功建立了孕中期羊水來源干細(xì)胞分離培養(yǎng)及向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化的技術(shù)體系，表明羊水來源干細(xì)胞分離培養(yǎng)簡(jiǎn)單，體外擴(kuò)增及分化能力強(qiáng)，經(jīng)多種細(xì)胞因子三階段誘導(dǎo)后，分化為具有肝細(xì)胞特