誘導胎盤來源間充質(zhì)干細胞向成牙骨質(zhì)細胞分化的實驗研究.pdf

1、牙周病涉及牙周膜、牙骨質(zhì)、牙槽骨三種不同組織，組織學表現(xiàn)為炎癥浸潤下的牙周膜退縮、牙槽骨吸收以及牙骨質(zhì)的暴露。牙周病牙周重建需要成骨細胞、成牙骨質(zhì)細胞以及牙周成纖維細胞的共同參與，但是因長期炎癥破壞，牙周病病病變區(qū)域的種子細胞數(shù)量有限，無法依靠自身種子細胞達到組織再生和功能重建，需要大量種子細胞移植至牙周病變區(qū)域，以滿足牙周組織重建的要求。而在牙周重建過程中，成牙骨質(zhì)細胞在牙周纖維的定植以及牙周膜的形成中起著重要作用，因此，選取可向成牙

2、骨質(zhì)細胞定向分化的種子細胞，是牙周重建的關(guān)鍵。
　　作為一類具有多向分化潛能的干細胞，間充質(zhì)干細胞在組織器官損傷修復以及再生治療方面，表現(xiàn)出廣闊的應用前景。目前，已經(jīng)在許多成人組織中成功分離出了不同組織來源的間充質(zhì)干細胞，并且成功應用于重建受損組織和細胞基因治療。在多種間充質(zhì)干細胞中，胎盤來源間充質(zhì)干細胞來源更原始，多向分化能力更強;來源充足，無倫理問題;免疫原性低，可同種異體或異種移植;病毒感染率低，安全性高等方面的優(yōu)點，具有更

3、好的臨床應用前景。
　　而誘導間充質(zhì)干細胞定向分化，需要建立合適的誘導微環(huán)境。在牙周組織發(fā)育過程中，釉基質(zhì)蛋白衍生物起著不可或缺的作用。研究發(fā)現(xiàn)釉原蛋白是釉基質(zhì)蛋白最主要的活性成分，在牙周發(fā)育及改建過程中，具有促進牙骨質(zhì)形成、牙周膜細胞增殖和骨誘導的能力，國內(nèi)外研究顯示其誘導干細胞向牙周表型分化效果可靠。
　　目的：
　　本實驗通過構(gòu)建釉原蛋白腺病毒載體建立體外誘導微環(huán)境，誘導胎盤來源間充質(zhì)干細胞向成牙骨質(zhì)細胞分化，同

4、時研究誘導非牙源性干細胞獲得的再生牙周細胞在正畸力作用下的反應機制，為采用牙周組織工程進行牙骨質(zhì)重建提供新的種子細胞來源，并為再生牙周在正畸力下反應機制的研究提供參考依據(jù)。
　　材料和方法:
　　1.釉原蛋白腺病毒過表達載體的構(gòu)建
　　采用人X染色體的釉原蛋白cDNA編碼序列(GenBank Accession No.M86932)作為目的基因，在序列兩端分別加上EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點，全基因合成法合成。利用限

5、制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ，將釉原蛋白基因插入到腺病毒輔助載體，然后將釉原蛋白腺病毒輔助載體和腺病毒骨架載體共轉(zhuǎn)染293細胞，采用細胞內(nèi)同源重組方法，獲得復制缺陷型釉原蛋白腺病毒過表達載體。
　　2.胎盤來源間充質(zhì)干細胞的分離及鑒定
　　采用酶消化法消化人足月胎盤底蛻膜組織，通過密度梯度離心法獲取胎盤來源間充質(zhì)干細胞，倒置顯微鏡觀察細胞生長特點及形態(tài)變化;根據(jù)活細胞線粒體內(nèi)脫氫酶可還原CCK-8成有色的formazan

6、的原理，采用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖能力;利用不同細胞對光線的特征性散射原理，采用流式細胞儀檢測胎盤來源間充質(zhì)干細胞的細胞周期及干細胞免疫表型(CD73、CD90、CD105、CD29、CD31、CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR);采用成骨誘導液及成脂誘導液誘導胎盤來源間充質(zhì)干細胞向成骨細胞及脂肪細胞分化，證實盤來源間充質(zhì)干細胞的多向分化能力。
　　3.釉原蛋白腺病毒載體誘導胎盤來源間充質(zhì)干細胞向成牙骨質(zhì)

7、細胞分化的體外實驗
　　將釉原蛋白腺病毒過表達載體轉(zhuǎn)染胎盤來源間充質(zhì)干細胞，誘導其向成牙骨質(zhì)細胞分化。對轉(zhuǎn)染后的胎盤來源間充質(zhì)干細胞分別在細胞形態(tài)學、增殖活性、體外礦化能力及成牙骨質(zhì)細胞相關(guān)基因表達變化進行誘導后的細胞表型鑒定。同時，通過沉默F(xiàn)AK基因，研究非牙源性干細胞獲得的類成牙骨質(zhì)細胞在正畸力作用下破骨相關(guān)信號因子M-CSF、RANKL及OPG的反應機制。
　　結(jié)果:
　　1.采用細胞內(nèi)同源重組法獲得了高效過表達

8、釉原蛋白的重組腺病毒Ad-AMG及對照腺病毒Ad-EGFP載體，Ad-EGFP證實腺病毒載體轉(zhuǎn)染效率高。以病毒載體通用引物進行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物測序證實腺病毒載體攜帶的釉原蛋白基因序列與Gen Bank人X染色體的釉原蛋白基因序列完全符合，同時提取了轉(zhuǎn)染Ad-AMG后293細胞的總蛋白，經(jīng)Western-Blot檢測證實了釉原蛋白的表達。
　　2.本實驗培養(yǎng)的胎盤來源間充質(zhì)干細胞生長狀態(tài)良好，細胞呈現(xiàn)均一長梭形的成纖維細胞樣，

9、細胞呈平行或漩渦狀排列生長。流式細胞儀檢測細胞免疫表型證實細胞表達典型的間充質(zhì)干細胞表面抗原標記，不表達內(nèi)皮細胞及血細胞表面抗原標記。多向分化潛能的鑒定，成骨誘導培養(yǎng)3周以后，可見明顯高亮的礦化結(jié)晶，茜素紅染色表現(xiàn)為深紅色的結(jié)節(jié)。成脂誘導培養(yǎng)培養(yǎng)2周以后，可見細胞胞漿內(nèi)串珠狀或篩孔狀圓形空泡充滿整個細胞，油紅O染色表現(xiàn)為橘紅色的圓泡。
　　3.轉(zhuǎn)染釉原蛋白腺病毒過表達載體后，在釉原蛋白的誘導下，胎盤來源間充質(zhì)干細胞逐漸呈現(xiàn)典型的成

10、牙骨質(zhì)細胞形態(tài)，即由原來的長梭形向扁平狀、類圓形、多邊形或不規(guī)則形狀，細胞表面有短鈍突起;轉(zhuǎn)染后細胞增殖活性明顯降低，細胞蛋白合成功能增強;基因水平及蛋白水平檢測到了礦化因子BSP、OPN、OCN的表達，對照組為陰性，證明在釉原蛋白的誘導下胎盤來源間充質(zhì)干細胞具有了礦化能力，同時RT-PCR及免疫組化檢測到了牙骨質(zhì)特異性蛋白CAP的表達，證明胎盤來源間充質(zhì)干細胞分化為類成牙骨質(zhì)細胞。通過進一步研究類成牙骨質(zhì)細胞在壓應力作用下的反應機制發(fā)

11、現(xiàn)，類成牙骨質(zhì)細胞RANKL及M-CSF的mRNA表達水平與壓應力作用的時間成正比，隨著壓力加載時間的延長，RANKL/OPG的比值增大，結(jié)合M-CSF表達增高，說明在壓應力作用下，類成牙骨質(zhì)細胞具備誘導破骨細胞形成及分化的功能。在沉默F(xiàn)AK基因后，類成牙骨質(zhì)細胞RANKL及M-CSF的mRNA表達水平隨壓應力加載時間延長基本保持不變，但OPG的mRNA表達水平增高，RANKL/OPG的比值減小，通過干擾實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK基因參與了類成牙

12、骨質(zhì)細胞誘導破骨細胞分化及成熟的過程。
　　結(jié)論:
　　1.細胞內(nèi)同源重組法成功構(gòu)建了高效過表達釉原蛋白的重組腺病毒Ad-AMG及對照Ad-EGFP載體。Ad-AMG腺病毒載體轉(zhuǎn)染效率高且能夠正確地表達釉原蛋白。
　　2.采用膠原酶Ⅱ消化組織并通過密度梯度分選法篩選出的胎盤來源間充質(zhì)干細胞純度較高，細胞為均一長梭形的成纖維細胞樣，呈平行或漩渦狀排列生長。流式細胞儀及誘導分化實驗證實了其典型的間充質(zhì)干細胞特性。經(jīng)釉原蛋白

13、誘導后，胎盤來源間充質(zhì)干細胞在細胞形態(tài)學、細胞增殖活性、體外礦化能力以及成牙骨質(zhì)細胞特征性相關(guān)基因表達上，均顯示了一些成牙骨質(zhì)細胞特性。證實胎盤來源間充質(zhì)干細胞在合適的誘導環(huán)境下可以向成牙骨質(zhì)細胞分化。
　　3.誘導胎盤來源間充質(zhì)干細胞獲得的類成牙骨質(zhì)細胞在壓應力作用下具備了誘導破骨細胞發(fā)生、成熟的功能，證明了非牙源性干細胞誘導向牙周細胞分化后可以參與正畸治療中牙周組織的改建。同時，與細胞骨架重組有關(guān)的FAK基因參與了破骨相關(guān)信號