人牙囊細(xì)胞生物學(xué)特性及定向誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景牙周組織缺損最理想的愈合方式是達(dá)到牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周膜完全的功能性再生。牙周組織再生的基礎(chǔ)是牙周膜細(xì)胞(PDLCs)，但在某些類型牙周病損部位，PDLCs的來源非常有限，以致牙周組織很難達(dá)到有效的再生和重建，而組織工程技術(shù)有望解決這一難題。組織工程學(xué)是近年來發(fā)展起來的一門新學(xué)科，其基本方法是將體外培養(yǎng)的高濃度的功能相關(guān)的活細(xì)胞種植到具有一定空間結(jié)構(gòu)的三維支架上，再將此細(xì)胞支架復(fù)合物植入體內(nèi)，或在體外繼續(xù)培養(yǎng)，通過細(xì)胞之間的相互

2、粘附、生長(zhǎng)繁殖分泌細(xì)胞外基質(zhì)，從而形成具有一定結(jié)構(gòu)和功能的初級(jí)組織或器官后植入體內(nèi)，以達(dá)到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的。 牙周組織的形成和重建過程中同時(shí)有三種重要細(xì)胞參與：成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞，完全意義上的牙周再生應(yīng)達(dá)到牙槽骨、牙周膜、牙骨質(zhì)的同時(shí)再生，使得牙周組織工程具有其特殊性及較大的難度，特別是牙骨質(zhì)的再生是其決定性的因素。目前用于牙周組織工程研究的種子細(xì)胞主要有牙周膜細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞、胚胎來源干

3、細(xì)胞、基因轉(zhuǎn)染牙齦成纖維細(xì)胞等。 在牙齒發(fā)育過程中，牙周組織由牙囊細(xì)胞發(fā)育分化而來，牙囊中含有成牙骨質(zhì)、成纖維、成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞成份，在一定的誘導(dǎo)條件和環(huán)境作用下牙囊細(xì)胞可以向成牙骨質(zhì)、成骨細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化。來源于上皮根鞘的釉基質(zhì)蛋白(EMPs)被認(rèn)為在牙囊向牙周細(xì)胞特別是成牙骨質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育分化中起重要的調(diào)控作用，骨形成蛋白-2(BMP-2)是BMP家族中誘骨活性最強(qiáng)的一種，在牙齒發(fā)育早期為活躍的調(diào)控因子之一。目前已有研究證實(shí)，體

4、外條件下，EMPs或BMP-2均能影響牙囊細(xì)胞的生物學(xué)行為，并能誘導(dǎo)其向成骨、成牙骨質(zhì)細(xì)胞方向分化。因此，利用牙囊細(xì)胞體外培養(yǎng)，經(jīng)過誘導(dǎo)因子(如EMPs、BMP-2)的作用，使其具有牙骨質(zhì)、成骨細(xì)胞的分化趨勢(shì)后作為種子細(xì)胞用于牙周再生研究，理論上是可行的。此外，分離培養(yǎng)牙囊細(xì)胞了解其生物學(xué)特性，深入開展牙囊向牙周組織分化過程的分子機(jī)制、影響因素和調(diào)控方式的研究，不僅可能為牙周病的修復(fù)再生機(jī)制提供一些有利的思路，為牙周組織工程研究提供一些

5、理論基礎(chǔ)和依據(jù)，更重要的是對(duì)于豐富牙周和牙胚發(fā)育生物學(xué)理論亦起著至關(guān)重要的作用。目前研究中，多局限于牙囊細(xì)胞在牙胚發(fā)育及牙齒萌出過程中的調(diào)控機(jī)制，很少將牙囊細(xì)胞運(yùn)用于組織工程研究的報(bào)道。 研究目的研究牙囊細(xì)胞的生物學(xué)特性及其向牙周組織發(fā)育分化的機(jī)制，為牙周組織工程研究提供理論基礎(chǔ)。分離培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞，初步了解牙囊細(xì)胞特性及向牙周組織發(fā)育分化的機(jī)制；通過檢測(cè)細(xì)胞增殖活性、堿性磷酸酶活性及礦化能力、蛋白合成變化等，探討EMPs和BM

6、P-2促牙囊細(xì)胞分化的細(xì)胞學(xué)機(jī)理，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)其生物學(xué)特性；運(yùn)用三種不同載體對(duì)牙囊細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)，建立細(xì)胞/載體復(fù)合物，探討三種載體作為組織工程支架的可行性；初步嘗試將牙囊細(xì)胞及EMP、BMP-2應(yīng)用于體外牙周組織工程研究。 研究方法一、HDFC的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性分離合法引產(chǎn)胎兒牙胚根部的牙囊組織，運(yùn)用酶消化結(jié)合組織塊法獲得HDFC，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，并運(yùn)用免疫細(xì)胞方法、RT-PCR技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特

7、性鑒定，體外礦化培養(yǎng)觀察細(xì)胞礦化能力。 二、HDFC體外定向誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)MTT檢測(cè)法、酶動(dòng)力學(xué)法、動(dòng)態(tài)觀察礦化結(jié)節(jié)形成法、免疫細(xì)胞化學(xué)及圖像分析技術(shù)等檢測(cè)手段，觀察EMPs、BMP-2單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用對(duì)體外培養(yǎng)的HDFC增殖、分化、礦化能力及礦化相關(guān)蛋白分泌等生物學(xué)特性的影響，通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)EMPs、BMP-2作用于HDFC對(duì)牙骨質(zhì)附著蛋白(CAP)表達(dá)的影響，探討上述兩種生長(zhǎng)因子是否對(duì)牙囊細(xì)胞的分化

8、起誘導(dǎo)作用。 三、HDFC復(fù)層化及三維立體培養(yǎng)模型的建立將HDFC進(jìn)行復(fù)層化培養(yǎng)獲得組織工程載體，利用Ⅰ型膠原凝膠載體、烏賊骨轉(zhuǎn)化羥基磷灰石載體對(duì)HDFC進(jìn)行體外三維立體培養(yǎng)并構(gòu)建細(xì)胞/載體復(fù)合體，行裸鼠皮下種植，光鏡下、電鏡下觀察材料與細(xì)胞之間的相容性，通過組織學(xué)觀察評(píng)價(jià)三種載體復(fù)合HDFC在體內(nèi)自發(fā)分化情況。 結(jié)果一、分離培養(yǎng)HDFC及其生物學(xué)特性：運(yùn)用酶消化結(jié)合組織塊法能高效率獲得HDFC，細(xì)胞為成纖維細(xì)胞形態(tài)；免

9、疫細(xì)胞化學(xué)染色抗波形絲蛋白VIM(++)、抗角蛋白CK(-)，說明細(xì)胞來源于外胚間充質(zhì)，礦化相關(guān)蛋白COLⅠ、COLⅢ、BSP、OPN、ON為中度陽(yáng)性到弱陽(yáng)性表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示：HDFC中骨涎蛋白(BSP)、骨鈣素(OCN)、堿性磷酸酶(ALP)、mcpr1為低到中度表達(dá)，在不同分子量片段處呈現(xiàn)為不同灰度值的特異性條帶，未檢測(cè)到牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)和核心結(jié)合因子α1(cbfa1)的表達(dá)；體外礦化條件下培養(yǎng)的HDFC在20天

10、時(shí)可觀察到細(xì)小的顆粒狀礦化結(jié)節(jié)形成，30天時(shí)Vonkossa染色(+)。 二、EMPs和BMP-2對(duì)HDFC體外定向誘導(dǎo)分化結(jié)果：1.50、100、200mg/L的EMPs，50、100、200ug/LBMP-2對(duì)HDFC起促增殖作用。其中EMPs100mg/L、BMP-2100ug/L的濃度為最佳促增殖濃度，并且這種促增殖效應(yīng)從第3d起即顯效，可一直持續(xù)至第7d。在聯(lián)合應(yīng)用EMPs和BMP-2時(shí)，對(duì)HDFC亦具有顯著促增殖作用

11、，但聯(lián)合應(yīng)用二者對(duì)牙囊細(xì)胞的增殖活性的影響不存在協(xié)同或拮抗作用(P＞0.05)。 2.100、200mg/L的EMPs，25、50、100、200ug/L的BMP-2均可明顯促進(jìn)細(xì)胞分泌ALP，這種促進(jìn)作用在第3d時(shí)即出現(xiàn)。聯(lián)合應(yīng)用二者時(shí)亦能促進(jìn)HDFC分泌ALP，并且聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HDFC的促ALP分泌起協(xié)同作用(與單獨(dú)應(yīng)用相比P＜0.05)；觀察EMPs、BMP-2對(duì)細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成能力的影響：在礦化培養(yǎng)液中添加100ug/L的

12、BMP-2、100ug/L的BMP-2+100mg/L的EMPs均可加快牙囊細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成，而單獨(dú)加入100mg/L的EMPs對(duì)牙囊細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)形成能力無明顯影響。 3.HDFC在無外界刺激因素作用下其分泌膠原蛋白COLⅠ的能力可隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加(表現(xiàn)為免疫組化染色加深，灰度值減小，P＜0.05)，而分泌COLⅢ、BSP、OPN、ON的能力無變化(P＞0.05)；利用100mg/LEMPs和100ug/LBMP-2誘導(dǎo)HD

13、FC，均顯著促進(jìn)細(xì)胞分泌COLⅠ、COLⅢ、BSP、OPN、ON，表現(xiàn)為染色加深，灰度值下降，在3d時(shí)這些指標(biāo)的表達(dá)即已顯著升高(P＜0.01)，并隨時(shí)間延長(zhǎng)這種促進(jìn)分泌作用日益明顯(7d時(shí)灰度值與3d組相比P＜0.01)。 4.在對(duì)不同誘導(dǎo)因子作用于HDFC后對(duì)其CAP表達(dá)影響的檢測(cè)中，100ug/LBMP-2作用HDFC7d時(shí)抗CAP染色為陽(yáng)性，而100mg/LEMPs作用細(xì)胞未能檢測(cè)到CAP的表達(dá)。 三、利用復(fù)層化

14、細(xì)胞、Ⅰ型膠原、烏賊骨轉(zhuǎn)化羥基磷灰石載體建立細(xì)胞/載體復(fù)合物：組織學(xué)切片、顯微鏡、電鏡觀察均顯示，細(xì)胞在三種載體內(nèi)生長(zhǎng)狀態(tài)良好，三種載體均具有良好的細(xì)胞相容性。裸鼠皮下種植組織學(xué)切片表明，僅復(fù)層化植入組觀察到了少量類礦化基質(zhì)形成，但免疫組化牙骨質(zhì)附著蛋白抗體染色為陰性。 結(jié)論1.酶消化結(jié)合組織塊法可獲得HDFC，具有一定的成骨/成牙骨質(zhì)細(xì)胞特性。 2.EMPs、BMP-2可影響HDFC的增殖、分化、調(diào)節(jié)其蛋白合成，在HD