細(xì)胞外囊泡研究新進(jìn)展

1、中國組織工程研究第21卷第4期2017–02–08出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchFebruary82017Vol.21No.4ISSN20954344CN211581RCODEN:ZLKHAH621綜述www.CRTER.g王琎，女，1989年生，漢族，河南省人，碩士。通訊作者：陳建英，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)三區(qū)，廣東省湛江市524001中圖分類號:R394

2、.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:20954344(2017)040062106稿件接受：20161126WangJinMasterGraduateSchoolofGuangdongMedicalUniversityZhanjiang524001GuangdongProvinceChinaCrespondingauth:ChenJianyingChiefphysicianMaster’ssupervisThirdDepartmentofCar

3、diologyAffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversityZhanjiang524001GuangdongProvinceChina細(xì)胞外囊泡研究新進(jìn)展王琎1，陳建英2(1廣東醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣東省湛江市524001；2廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)三區(qū)，廣東省湛江市524001)引用本文：王琎，陳建英.細(xì)胞外囊泡研究新進(jìn)展[J].中國組織工程研究，2017，21(4):621626.DOI:

4、10.3969j.issn.20954344.2017.04.022CID:0000000344943898(王琎)文章快速閱讀：文題釋義：細(xì)胞外囊泡：是由脂質(zhì)雙分子層包繞形成的球狀膜性囊泡，是細(xì)胞自發(fā)或在一定條件下釋放出的一種亞細(xì)胞成份，實質(zhì)上是一組納米級顆粒，近年來學(xué)界研究的熱點，包括外泌體、膜微粒及微囊泡等。自噬：這是發(fā)生在細(xì)胞代謝過程以清除代謝廢物或維持細(xì)胞器更新的一種現(xiàn)象，其過程如下：首先細(xì)胞的一些成分將部分細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞

5、內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分包裹起來形成自噬體，接著自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，目前研究發(fā)現(xiàn)自噬在機體的生理和病理過程中均能見到。摘要背景：細(xì)胞外囊泡是細(xì)胞旁分泌產(chǎn)生的一種亞細(xì)胞成分，近年來學(xué)界研究的熱點——外泌體、膜微粒及微囊泡等均在其范疇。目的：就細(xì)胞外囊泡定義分類、形成釋放過程、分離鑒定方法、生物學(xué)意義及其在臨床疾病和生物醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用等方面的最新進(jìn)展作一綜述。方法：由第一作者在PubMed、CNKI

6、等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，關(guān)鍵詞為”ExtracellularVesicles，exosome，microvesicle，microparticle”及“細(xì)胞外囊泡、外泌體、微囊泡、膜微粒”。檢索時間為2006年7月至2016年8月。結(jié)果與結(jié)論：共納入44篇文獻(xiàn)。幾乎所有的細(xì)胞都能產(chǎn)生細(xì)胞外囊泡，其中含有脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸(DNA、mRNA及micrNA、lncRNA、circRNA等noncodingRNA)等多種母細(xì)胞來源的生物活性成

7、份，這些信息物質(zhì)包裹在囊泡中或攜帶于膜上。他們參與炎癥免疫反應(yīng)、細(xì)胞間信號通訊、細(xì)胞存活與凋亡、血管新生、血栓形成、自噬等，在生理狀態(tài)維持及疾病的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。特定類型的細(xì)胞外囊泡有望成為輔助疾病診斷及預(yù)后判斷的新分子標(biāo)記物；在抗腫瘤治療、再生醫(yī)學(xué)、免疫調(diào)節(jié)等方面也有著廣闊前景；能為干細(xì)胞治療非細(xì)胞途徑開辟新路徑；有可能作為疫苗或藥物的天然載體為臨床治療帶來福音。細(xì)胞外囊泡分泌的分子機制及其作用于靶細(xì)胞引起生物學(xué)功能變化的具體成分

8、及其信號通路尚在研究中，以研究miRNA者為主，近年來lncRNA、circRNA開始成為新星逐漸走進(jìn)學(xué)者視野。關(guān)鍵詞：組織構(gòu)建；組織工程；細(xì)胞外囊泡；外泌體；組織再生；自噬；藥物載體；非編碼RNA；免疫炎癥；國家自然科學(xué)基金主題詞：組織工程；外泌體；再生；自噬；藥物載體基金資助：國家自然科學(xué)基金資助項目(81370242)ResearchprogressofextracellularvesiclesWangJin1ChenJianyi

9、ng2(1GraduateSchoolofGuangdongMedicalUniversityZhanjiang524001GuangdongProvinceChina2ThirdDepartmentofCardiologyAffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversityZhanjiang524001GuangdongProvinceChina)AbstractBACKGROUND:Extra

10、cellularvesicles(EVs)areakindofsubcellularcomponentproducedbyparacinemechanismincludingexosomesmicroparticlesmicrovesicleswhichhavebecomehotspotsinrecentyears.OBJECTIVE:ToreviewtheresearchstatusprogressofEVsespeciallyint

11、hestudiesaboutdefinitionsecretingmechanismisolationidentificationbiologicalacteristicsfunctionsindiseasesaswellasinbiomedicalresearch.METHODS:ThefirstauthretrievedPubMedCNKIdatabasesfrelativearticlespublishedfromJuly2006

12、toAugust2016.Thekeywdswere“extracellularvesiclesexosomemicrovesiclemicroparticle”inEnglishChineserespectively.細(xì)胞外囊泡的生物學(xué)意義：概念及一般生物學(xué)特性分離提取及鑒定方法在生物醫(yī)學(xué)研究中的意義細(xì)胞外囊泡文獻(xiàn)檢索綜述分析近年相關(guān)研究進(jìn)展王琎，等.細(xì)胞外囊泡研究新進(jìn)展ISSN20954344CN211581RCODEN:ZLKHA

13、H623www.CRTER.g胞活化、氧化應(yīng)激、細(xì)胞癌性轉(zhuǎn)化、放射損傷、細(xì)胞死亡和(或)凋亡等[16]，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)低氧或低營養(yǎng)誘導(dǎo)后會分泌釋放細(xì)胞外囊泡[17]。細(xì)胞外囊泡形成、釋放的分子機制不完全清楚，可能與細(xì)胞膜重構(gòu)和細(xì)胞骨架改變有關(guān)。既往蛋白質(zhì)組學(xué)、基因芯片分析及RTPCR等顯示細(xì)胞外囊泡選擇性地將母細(xì)胞來源的多種生物活性物質(zhì)包裝進(jìn)其雙分子層膜結(jié)構(gòu)中或攜帶于膜表面，如脂質(zhì)(如富含膽固醇和鞘磷)、細(xì)胞因子、趨化因子、生長因

14、子、特異性及非特異性蛋白、DNA、mRNA、micrNA、lncRNA、circRNA等[14，1821]。外泌體：分子直徑30100nm，也有很多學(xué)者認(rèn)為在150nm范圍內(nèi)的，來源于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷的初級核內(nèi)體的微粒都屬于外泌體，這類囊泡在細(xì)胞內(nèi)部形成，與一般的出芽方式不同。其形成釋放過程是，母細(xì)胞釋放顆粒物質(zhì)到質(zhì)膜內(nèi)陷形成的核內(nèi)體腔內(nèi)囊泡中，含有腔內(nèi)囊泡的核內(nèi)體成為次級核內(nèi)體，也稱作多囊泡胞內(nèi)體或多泡小體。隨后，多泡小體離開溶酶體途徑而

15、與母細(xì)胞胞膜特定部位融合，之后胞內(nèi)體中的微小囊泡朝向內(nèi)體囊腔的內(nèi)部形成芽泡，繼而母細(xì)胞將這種芽泡以外泌的形式釋放到細(xì)胞外。由于外泌體特殊的分泌方式，其所含蛋白組分有別于其他細(xì)胞外囊泡，不含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白質(zhì)，而高表達(dá)與主要組織相容性復(fù)合體以及整合素等多種蛋白質(zhì)相互作用的四分子交聯(lián)體超蛋白家族，如CD9，CD81，CD63以及熱休克蛋白，如熱休克蛋白60，70，90和部分細(xì)胞內(nèi)源性蛋白如Alix，Tsg101等，低表達(dá)磷脂酰絲氨酸。微囊泡

16、：分子直徑1001000nm，也有文獻(xiàn)稱之為脫落囊泡或Ectosomes。形成過程相對簡單，是直接通過出芽方式從母細(xì)胞膜表面脫落產(chǎn)生，大小不均一，高表達(dá)磷脂酰絲氨酸，沒有特定的表面分子標(biāo)記物，但和外泌體一樣表達(dá)母細(xì)胞來源的表面標(biāo)記物[22]。如EMV表達(dá)CD31，PMV表達(dá)CD42b，白細(xì)胞來源的表達(dá)CD45，網(wǎng)織紅細(xì)胞來源的表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體分子，抗原呈遞細(xì)胞來源的富含MHCⅠ，Ⅱ。微囊泡中也含有如金屬蛋白酶等外泌體中不包含的一些物質(zhì)。

17、凋亡小體：是細(xì)胞程序性死亡或凋亡晚期釋放的微粒，文章不贅述，這類囊泡顆粒較大，分子直徑為5004000nm，具有AnnexinV高親和力，富含死細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)碎片的濃縮DNA，能將這些DNA運載入巨噬細(xì)胞細(xì)胞核中。2.3細(xì)胞外囊泡分離提取和鑒定方法目前，學(xué)界普遍認(rèn)同差速離心法是提取細(xì)胞外囊泡的標(biāo)準(zhǔn)方法[23]。先低速離心去除死亡的細(xì)胞和大的細(xì)胞碎片，再高速離心去除可溶性蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)聚集體及其他與細(xì)胞外囊泡共沉淀的雜質(zhì)，即可分離得到微

18、囊泡和外泌體。對細(xì)胞外囊泡純度要求較高時可采用密度梯度離心或免疫磁珠分選的方法來純化細(xì)胞外囊泡。前者是在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續(xù)分布的密度階層，是一種區(qū)帶分離法。免疫磁珠分選技術(shù)則是利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，用包被抗標(biāo)記物抗體的磁珠與細(xì)胞外囊泡孵育后結(jié)合，這樣就能將特定的細(xì)胞外囊泡分選出來。此外，分離提取細(xì)胞外囊泡的方法還有諸如微孔過濾技術(shù)、微流控技術(shù)、高效液相色譜法以及細(xì)胞外囊泡提取試劑盒。隨著研究的深入，目前

19、對細(xì)胞外囊泡也進(jìn)行蛋白、DNARNA提取，有學(xué)者使用傳統(tǒng)方法提取，也有研究者用BioVision等公司的提取試劑盒，總的來說各種技術(shù)各有利弊。關(guān)于細(xì)胞外囊泡的鑒定，已有許多技術(shù)能表征以及分析納米顆粒和納米囊泡。其中包括：蛋白免疫印跡、流式細(xì)胞學(xué)、酶聯(lián)免疫吸附分析、動態(tài)光散射、透射電鏡檢查法、納米顆粒跟蹤分析技術(shù)。蛋白免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)是對細(xì)胞外囊泡中蛋白進(jìn)行分析，流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)能分析細(xì)胞外囊泡攜帶的細(xì)胞表面抗原標(biāo)記物；透射電

20、鏡檢查法技術(shù)可以分析細(xì)胞外囊泡分子直徑和形態(tài)結(jié)構(gòu)；納米顆粒跟蹤分析技術(shù)可實時地對低濃度的細(xì)胞外囊泡懸浮液中501000nm直徑范圍內(nèi)特定的細(xì)胞外囊泡進(jìn)行分子波峰及濃度測定。2.4細(xì)胞外囊泡生物學(xué)功能2.4.1細(xì)胞外囊泡所攜帶信息物質(zhì)目前Vesiclepedia中記錄了來自33種不同種類的538份研究統(tǒng)計分析出細(xì)胞外囊泡中含有92897種蛋白，27642種mRNAs，4934種miRNAs和584種脂質(zhì)等(數(shù)據(jù)是在2015年9月前收錄)[

21、24]。蛋白質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白包括血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β、MAPK通路信號分子、RHO通路信號分子、Tie2TEK及細(xì)胞黏附分子等。這些蛋白質(zhì)分子部分是酶類，酶催化具有高效性，能夠放大其效應(yīng)，相比RNA，進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)能夠即時迅速發(fā)揮作用，在維持血管新生以及維持血管功能及修復(fù)損傷組織等方面起主要作用。Ratajczak等[25]證實小鼠胚胎干細(xì)胞來源的MVs能把蛋白質(zhì)和mRN