α-synuclein與Ⅱ型囊泡單胺轉(zhuǎn)移體作用關(guān)系的研究.pdf

1、帕金森氏病(PD)是一種主要由于黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元損害造成的神經(jīng)退行性疾病，以Lewy小體的形成為主要病理特征。α-synuclein是Lewy小體的主要組成成分，在PD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。其兩種類型的突變A53T和A30P與家族遺傳性PD的發(fā)病相關(guān)。盡管過量表達(dá)α-synuclein能夠造成多巴胺能神經(jīng)末梢的變性，但其具體分子機(jī)制仍然不清楚。目前關(guān)于α-synuclein導(dǎo)致神經(jīng)元變性的一個(gè)重要假說是多巴胺代謝產(chǎn)物活性氧

2、類物質(zhì)(ROS)的產(chǎn)生，它能夠造成脂質(zhì)，蛋白質(zhì)和DNA等分子大生物的氧化損害，并抑制線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ的功能，造成神經(jīng)元的變性，這可能是帕金森氏病的主要發(fā)病機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)α-synuclein對(duì)神經(jīng)元的損害作用是多巴胺依賴性的，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺的代謝以及活性氧類物質(zhì)的產(chǎn)生過程中發(fā)揮著重要的作用，但α-synuclein導(dǎo)致活性氧類物質(zhì)(多巴胺)增多的具體機(jī)制尚未完全明了。 Ⅱ型囊泡單胺轉(zhuǎn)移體(VMAT2)是哺乳動(dòng)物中樞

3、神經(jīng)系統(tǒng)唯一有功能的生物胺囊泡轉(zhuǎn)移體，它能夠?qū)⑸窠?jīng)元合成的的多巴胺迅速的轉(zhuǎn)移到突觸囊泡進(jìn)行儲(chǔ)存，避免發(fā)生降解產(chǎn)生活性氧類物質(zhì)，造成神經(jīng)元的損害。為了研究α-synuclein與VMAT2的作用關(guān)系，在本研究中，通過雙重免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)α-synuclein與Ⅱ型囊泡單胺轉(zhuǎn)移體在小鼠的黑質(zhì)神經(jīng)元腦區(qū)域的分布高度一致。在原核細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)帶有GST標(biāo)簽的野生型及突變型A53T和A30P的融合蛋白質(zhì)，通過考馬斯亮藍(lán)R-250及Western-

4、blot檢測發(fā)現(xiàn)這三種蛋白在原核細(xì)胞中均有高效的表達(dá)。以這三種蛋白為誘餌，通過GST-PullDown試驗(yàn)與人腦蛋白提取物相互結(jié)合，我們發(fā)現(xiàn)無論是GST融合野生型還是突變型A53T和A30Pα-synuclein都能夠與人VMAT2在體外條件下相互作用形成復(fù)合物。通過基因克隆的方法構(gòu)建攜帶人VMAT2的真核細(xì)胞表達(dá)載體，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人VMAT2蛋白的神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞系，通過免疫熒光技術(shù)及Western-

5、blot檢測發(fā)現(xiàn)人VMAT2在該細(xì)胞系中有高效穩(wěn)定的表達(dá)。在穩(wěn)定表達(dá)VMAT2的細(xì)胞系中，分別瞬時(shí)表達(dá)野生型，突變型A53T和A30Pα-synuclein36小時(shí)后進(jìn)行[3H]Dopamine攝取實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示表達(dá)野生型，突變型A53T和A30Pα-synuclein分別能夠使細(xì)胞對(duì)[3H]Dopamine的攝取量增多39％，65％和47％。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示α-synuclein能夠與VMAT2結(jié)合形成功能性復(fù)合物，并能夠通過對(duì)V