銅綠假單胞菌外膜囊泡的研究.pdf

1、第一部分 PAO1外膜囊泡的提取的方法學建立及優(yōu)化
　　目的:建立并優(yōu)化銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）外膜囊泡(out membrane vesicle，OMV)體外的提取及純化方法，為研究OMV的生物學活性及誘導感染發(fā)生的機制奠定基礎。
　　方法:以銅綠假單胞菌標準株PAO1為模式菌，分別采用分別采取超濾濃縮法和Optiripe密度梯度超速離心分離法提取PAO1的外膜囊泡，負染電鏡檢測形

2、態(tài)及純度;BCA法檢測兩種方法提取的OMV蛋白濃度并計算OMV產量。
　　結果:超濾濃縮法提取的OMV含有較多雜質，產量為21.3ug/1010個細菌，密度梯度離心提取的OMV無明顯雜質存在，產量為48.7ug/1010個細菌。
　　結論:超濾濃縮法和Optiripe密度梯度超速離心法均可用于提取PA的外膜囊泡，但Optiripe密度梯度離心法提取的OMV的產率和純度均高于超濾濃縮法提取OMV。
　　第二部分 PAO1

3、外膜囊泡的成分及生物學活性檢測
　　目的:初步檢測PAO1的OMV中所含蛋白，建立OMV體內體外感染模型，檢測OMV的生物學活性
　　方法:用SDS-PAGE電泳初步鑒定OMV中所含蛋白條帶，建立OMV感染人支氣管上皮細胞BEAS-2B，ELISA檢測炎性因子IL-6、IL-8的表達水平;通過滴鼻方式建立OMV感染Bab1c小鼠模型，提取小鼠肺組織，HE染色觀察其炎性變化;通過多粘菌素B抵抗實驗，檢測OMV對細菌的保護作用。

4、
　　結果:SDS-PAGE電泳結果顯示PAO1的OMV中含有多種蛋白條帶，主要為10-100KDa大小的蛋白;PAO1的OMV能顯著誘導Base-2B細胞表達炎性因子IL-6、IL-8，刺激Ba1bc小鼠肺組織發(fā)生明顯的炎性變化，且能幫助PAO1抵抗多粘菌素B的殺害。
　　結論:PAO1分泌的外膜囊泡為一個含有多種蛋白的混合體，具有誘導宿主細胞產生炎性反應以及保護感染細菌抵抗周圍不利環(huán)境等多種生物學活性。
　　第三部

5、分 lasB對PAO1外膜囊泡的影響
　　目的:探討lasB基因對PAO1的OMV的形態(tài)、分泌量、及防御功能的影響。
　　方法:PCR鑒定PAO1標準株和lasB缺陷的PAO1株，用Optiripe密度梯度超速離心法提取PAO1標準株和lasB缺陷株的外膜囊泡，負染電鏡觀察兩種外膜囊泡的形態(tài)、BCA法檢測OMV蛋白濃度，計算OMV產率，通過剛果紅實驗比較兩種外膜囊泡彈性蛋白酶活性大小，建立OMV感染正常人外周血單個核細胞模型

6、，通過計算細菌吞噬率檢測OMV保護細菌抵抗單個核細胞吞噬的能力。
　　結果:PAO1標準株和lasB缺陷株體外分泌的外膜囊泡形態(tài)一致，均為20-200nm的球形結構。與lasB缺陷株相比，PAO1標準株的OMV產率更高，所具有的彈性蛋白酶活性更強，且?guī)椭毦挚谷送庵苎獑蝹€核細胞吞噬的能力更強。
　　結論:lasB缺陷對PAO1體外分泌的外膜囊泡形態(tài)無影響，但lasB缺陷后，外膜囊泡的分泌量、所含彈性蛋白酶活性以及對細菌的保