ACTIN在哺乳動(dòng)物細(xì)胞早期內(nèi)涵體上轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡形成過程中的作用研究.pdf

1、在真核細(xì)胞中，胞吞途徑中區(qū)室化形態(tài)結(jié)構(gòu)是胞吞分子胞內(nèi)分選轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，而區(qū)室化形態(tài)結(jié)構(gòu)之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信息交流依賴于囊泡的形成與轉(zhuǎn)運(yùn)。早期內(nèi)涵體（early endosome，EE）作為胞吞途徑中高度動(dòng)態(tài)的區(qū)室化形態(tài)結(jié)構(gòu)，是胞吞貨物的分選平臺(tái)。EE通過高度動(dòng)態(tài)的管狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行貨物蛋白的循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)，或通過膜內(nèi)陷形成腔內(nèi)囊泡將胞吞貨物轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中進(jìn)行降解。胞吞物質(zhì)在EE上的分選與轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)復(fù)雜而又精細(xì)的過程，需要多種蛋白和脂質(zhì)的參與，它們共

2、同調(diào)控EE上胞吞物質(zhì)的分選與轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡的形成。前期研究表明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，ACTIN與EE上物質(zhì)的分選和轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡的形成密切相關(guān)。然而，ACTIN在轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡形成過程中膜的重塑，主要包括膜的成管和剪切作用機(jī)制仍不清楚。
　　鑒于此，在本研究中，不同種屬哺乳動(dòng)物細(xì)胞COS-7和HeLa細(xì)胞作為研究載體；借助熒光標(biāo)記和激光共聚焦熒光顯微成像技術(shù)，觀察ACTIN在COS-7和HeLa細(xì)胞內(nèi)涵體/溶酶體系統(tǒng)上的定位情況。為了觀察ACTIN和

3、其調(diào)控因子WASH在EE上轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡形成中的動(dòng)態(tài)行為，在COS-7細(xì)胞上瞬時(shí)表達(dá)常激活型熒光標(biāo)簽RAB5蛋白（RAB5 Q79L）和LifeAct-mKate2或GFP-WASH；由于表達(dá)RAB5 Q79L，造成EE發(fā)生同源融合，從而形成空泡結(jié)構(gòu)，形成的空泡結(jié)構(gòu)有利于在熒光顯微鏡分辨率有限的情況下觀察EE上的動(dòng)態(tài)事件。通過藥物處理抑制ACTIN動(dòng)態(tài)組裝實(shí)驗(yàn)探索了ACTIN在EE上轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡形成過程中的具體作用機(jī)制；同時(shí)也借助藥物處理實(shí)驗(yàn)進(jìn)一

4、步探究了ACTIN功能缺陷對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，Tfn）和10 KDa Dextran在胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。最后，借助熒光三標(biāo)記和活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像技術(shù)，初步探索了ACTIN和WASH在EE上轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡形成事件中兩者在動(dòng)態(tài)行為上的相關(guān)性。
　　ACTIN胞內(nèi)定位研究數(shù)據(jù)顯示，ACTIN在COS-7和HeLa細(xì)胞中的定位呈現(xiàn)高度一致性，主要分布在EE上，在循環(huán)內(nèi)涵體（recycling endosomes，RE）上有少量數(shù)量上的

5、分布，且以離散型ACTIN微域的形式分布在EE膜上。熒光標(biāo)記活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在COS-7細(xì)胞中，ACTIN和WASH與EE上轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡的形成密切相關(guān)。COS-7上藥物處理實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)使用Latrunculin B抑制ACTIN動(dòng)態(tài)組裝時(shí)，會(huì)造成EE上可能由于剪切功能缺陷而出現(xiàn)長膜管狀結(jié)構(gòu)；同時(shí)在HeLa細(xì)胞上藥物處理實(shí)驗(yàn)表明，ACTIN功能缺陷會(huì)影響Tfn和10 KDa Dextran胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，造成Tfn和10 KDa Dex