顳葉癲癇大鼠認知功能與突觸重塑相關(guān)蛋白表達的研究.pdf

1、研究背景: 癲癇是嚴重危害人類健康的慢性腦部疾病之一，癲癇發(fā)作易導致認知和行為異常，全世界目前約有5000萬癲癇患者，給社會、家庭和個人都帶來了沉重負擔。顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy， TLE）是癲癇發(fā)作中最常見的類型，自發(fā)性再發(fā)作（spontaneous recurrent seizure，SRS）是其特征，發(fā)作大多由顳葉及其附近的病變引起，臨床上常表現(xiàn)為感覺、情緒、精神和運動等各種癥狀。由于顳葉癲癇

2、的發(fā)作與海馬等邊緣系統(tǒng)的病變密切相關(guān)，而海馬等又參與了記憶、學習、情緒、行為等認知功能的形成，所以，最近有關(guān)顳葉癲癇引起的認知功能障礙逐漸受到了人們的重視。認知功能是人類和動物的大腦高級神經(jīng)活動，主要包括精神、智力活動的各個方面，如感覺、知覺、學習、記憶，其中最主要的是學習和記憶。學習、記憶的形成是十分復雜的，最近的研究表明，海馬結(jié)構(gòu)、突觸的可塑性、抑制性氨基酸受體、鈣離子、一氧化氮（nitrogen monoxidum，NO）等參與了

3、學習與記憶的過程。一些與突觸重塑相關(guān)的蛋白被認為是突觸可塑性的主要調(diào)控者。目前，突觸重塑相關(guān)蛋白在癲癇發(fā)作中的作用與機制已有少量報道，但是突觸重塑相關(guān)蛋白在顳葉癲癇認知功能障礙中的作用和機制卻不十分清楚，對顳葉癲癇認知功能障礙的預防和治療也缺乏有效手段。 第一部分顳葉癲癇大鼠認知損害與海馬區(qū)synaptophysin、SNAP-25、synaptotagmin1的異常表達 目的: 評價KA誘導的大鼠顳葉癲癇模型認

4、知功能損害；研究Syp、SNAP-25、Syt1在顳葉癲癇認知功能障礙大鼠海馬區(qū)的表達，探討導致顳葉癲癇認知功能損害的可能分子機制。 方法: 1．應(yīng)用腹腔注射系統(tǒng)給藥的方法建立KA誘導的大鼠癲癇模型。實驗動物分為對照組、KA組，根據(jù)是否發(fā)展為SRS，KA組又分為顳葉癲癇組（KA+SRS組）、非顳葉癲癇組（KA-SRS組）。 2．應(yīng)用行為學檢測方法評價各組大鼠在致癇后6周（weeks，w）的認知功能。 3．

5、應(yīng)用HE、Nissl染色觀察KA+SRS組、KA-SRS組大鼠在致癇后6w海馬神經(jīng)元的形態(tài)及數(shù)目改變。 4．應(yīng)用免疫組織化學染色在電鏡下觀察各實驗組大鼠在致癇后6w海馬區(qū)Syp、SNAP-25、Syt1的表達。 5．應(yīng)用RT-PCR檢測各組大鼠在致癇后6w海馬區(qū)Syp、SNAP-25、Syt1mRNA的表達。 6．應(yīng)用Western blot檢測各組大鼠在致癇后6w海馬區(qū)Syp、SNAP-25、Syt1蛋白的表達

6、。 結(jié)果: 1．Morris水迷宮（Morris water maze）、高架十字迷宮（elevated-plus maze）、開場實驗（Open field）檢測顯示，與對照組比較，KA-SRS組大鼠認知功能未見明顯區(qū)別，KA+SRS組大鼠認知功能出現(xiàn)障礙（P<0．05）。 2．對照組大鼠海馬CA1、CA3、齒狀回門區(qū)錐體細胞結(jié)構(gòu)清晰完整，細胞核結(jié)構(gòu)正常，染色質(zhì)分布均勻，胞漿內(nèi)尼氏小體豐富，未見明顯神經(jīng)元丟失壞

7、死。KA+SRS組大鼠海馬CA1、CA2、CA3、CA4及齒狀回區(qū)未見廣泛神經(jīng)元丟失及膠質(zhì)增生，可見局部神經(jīng)元丟失和膠質(zhì)增生。KA-SRS組大鼠海馬未見明顯神經(jīng)元丟失。 3．Syp、SNAP-25、Syt1免疫組化研究顯示，對照組大鼠海馬可見數(shù)目較多、深染的棕褐色Syp、SNAP-25、Syt1陽性神經(jīng)元，與對照組比較，KA-SRS組無明顯差別，KA+SRS組Syp、SNAP-25陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯較少、染色較淺，Syt1陽性神

8、經(jīng)元數(shù)目明顯增多、染色較深。 4．RT-PCR研究顯示，與對照組比較，KA-SRS組Syp、SNAP-25、Syt1mRNA表達無明顯差別，KA+SRS組Syp、SNAP-25 mRNA表達減弱（P<0．05）、Syt1mRNA表達無明顯差別。 5．Western blot研究顯示，與對照組比較，KA-SRS組Syp、SNAP-25、Syt1蛋白表達無明顯差別，KA+SRS組Syp、SNAP-25蛋白表達減弱（P<0．0

9、5），Syt1蛋白表達增強（P<0．05）。 結(jié)論: 1．顳葉癲癇長期反復發(fā)作可以導致認知功能障礙。 2．本實驗中顳葉癲癇長期反復發(fā)作6w后未見廣泛神經(jīng)元丟失及膠質(zhì)增生，可見局部神經(jīng)元丟失和膠質(zhì)增生。 3．顳葉癲癇長期反復發(fā)作可導致Syp、SNAP-25表達減弱、Syt1表達增強，從而導致認知功能障礙。 第二部分顳葉癲癇大鼠認知功能變化與海馬區(qū)NR2B/PSD-95動態(tài)表達的研究 目的:

10、 評價KA誘導的大鼠顳葉癲癇模型認知功能變化；研究NR2B/PSD-95在顳葉癲癇認知功能障礙大鼠海馬區(qū)的動態(tài)表達及抗癲癇藥物丙戊酸鈉（valproic acid，VPA）對顳葉癲癇認知功能及海馬區(qū)NR2B/PSD-95表達的影響，探討導致顳葉癲癇認知功能障礙的可能分子機制。 方法: 1．應(yīng)用腹腔注射系統(tǒng)給藥的方法建立KA誘導的大鼠顳葉癲癇模型。實驗動物分為對照組、KA組、KA+VPA組，根據(jù)行為學檢測時間，以上三

11、個組再各自分為2w、4w、6w三個亞組。 2．應(yīng)用行為學檢測方法評價各亞組大鼠認知功能的變化。 3．應(yīng)用Nissl染色觀察KA組、KA+VPA組大鼠癲癇長期反復發(fā)作后6w海馬神經(jīng)元的形態(tài)及數(shù)目改變。 4．應(yīng)用免疫組織化學染色在電鏡下觀察各亞組大鼠癲癇長期反復發(fā)作后海馬區(qū)NR2B/PSD-95的動態(tài)表達。 5．應(yīng)用RT-PCR觀察各亞組大鼠癲癇長期反復發(fā)作后海馬區(qū)NR2B/PSD-95mRNA的動態(tài)表達。

12、 6．應(yīng)用Western blot檢測各亞組大鼠癲癇長期反復發(fā)作后海馬區(qū)NR2B/PSD-95蛋白的動態(tài)表達。 結(jié)果: 1．Morris水迷宮（Morris water maze）、高架十字迷宮（elevated-plus maze）、開場實驗（Open field）檢測顯示KA-2w亞組、對照組及KA+VPA各亞組大鼠的認知功能未見明顯區(qū)別，KA各亞組大鼠隨時間的延長認知功能障礙逐漸加重（P<0．05）。

13、 2．NS-6w、KA+VPA-6w組大鼠海馬CA1、CA3、齒狀回門區(qū)錐體細胞結(jié)構(gòu)清晰完整，細胞核結(jié)構(gòu)正常，染色質(zhì)分布均勻，胞漿內(nèi)尼氏小體豐富，未見明顯神經(jīng)元丟失。KA-6w亞組大鼠海馬CA1、CA2、CA3、CA4及齒狀回區(qū)未見廣泛神經(jīng)元丟失及膠質(zhì)增生，可見局部神經(jīng)元丟失和膠質(zhì)增生。 3．NR2B/PSD-95免疫組化研究顯示，對照組大鼠海馬可見數(shù)目較多、深染的棕褐色NR2B、PSD-95陽性神經(jīng)元。與對照組比較，KA+VP

14、A各亞組無明顯差別，KA-6w亞組NR2B、PSD-95陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯較少、染色較淺。 4．RT-PCR研究顯示，KA-2w亞組、對照組及KA+VPA各亞組大鼠NR2B/PSD-95 mRNA的表達未見明顯區(qū)別，KA各亞組大鼠隨時間的延長NR2B/PSD-95 mRNA的表達逐漸減弱（P<0．05）。 5．Western blot研究顯示，KA-2w亞組、對照組及KA+VPA各亞組大鼠NR2B/PSD-95蛋白的表達

15、未見明顯區(qū)別，KA各亞組大鼠隨時間的延長NR2B/PSD-95蛋白的表達逐漸減弱（P<0．05）。 結(jié)論: 1．顳葉癲癇大鼠長期反復發(fā)作可以導致認知功能障礙，且隨時間延長逐漸加重。 2．本實驗中顳葉癲癇長期反復發(fā)作6w后未見未見廣泛神經(jīng)元丟失及膠質(zhì)增生，可見局部性神經(jīng)元丟失和膠質(zhì)增生。 3．顳葉癲癇長期反復發(fā)作可導致NR2B/PSD-95表達逐漸減弱，從而導致認知功能障礙。 4．VPA可以通過保護

16、NR2B/PSD-95的表達，減輕顳葉癲癇長期反復發(fā)作導致的認知功能障礙。 研究意義: 本研究應(yīng)用KA制造大鼠顳葉癲癇模型，應(yīng)用行為學方法檢測顳葉癲癇導致的認知功能障礙，首次在成體動物水平證實突觸重塑相關(guān)蛋白如NR2B、PSD-95、synaptophysin、SNAP-25、synaptotagmin1參與顳葉癲癇發(fā)作導致的認知功能障礙，并同時證實了抗癲癇藥物VPA可以通過保護NR2B/PSD-95的表達，減輕顳葉癲癇