顳葉癲癇大鼠模型海馬和腦皮質(zhì)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、實驗?zāi)康?
　　 癲癇是多種原因?qū)е碌哪X神經(jīng)元高度同步化異常放電的臨床綜合征,是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病。顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy,TLE)是難治性癲癇的主要類型,其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。目前認(rèn)為海馬硬化是顳葉癲癇的一個顯著的病理特征,主要表現(xiàn)為海馬萎縮、神經(jīng)元脫失、膠質(zhì)細(xì)胞增生、齒狀回顆粒細(xì)胞彌散增寬和苔蘚纖維出芽等。
　　 神經(jīng)元異常放電是癲癇發(fā)病的電生理基礎(chǔ),它與離子通道蛋白和神經(jīng)遞質(zhì)異常

2、有關(guān)。異常放電通過反復(fù)的突觸聯(lián)系引起異常電位的連續(xù)傳播,從而將這種異常放電廣泛投射到大腦皮質(zhì),引起不同形式的癇性發(fā)作。由此看來,海馬和腦皮質(zhì)的病理改變與顳葉癲癇的發(fā)作密切相關(guān)。
　　 近年來,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用為我們更好的發(fā)現(xiàn)組織細(xì)胞的蛋白水平變化和探索疾病發(fā)病機(jī)制提供了用力的工具。蛋白質(zhì)組學(xué)是一門以蛋白質(zhì)為研究對象,在蛋白質(zhì)水平上對疾病機(jī)理進(jìn)行研究的技術(shù),已成為當(dāng)前生命科學(xué)研究的重點。
　　 本實驗運用比較蛋白

3、質(zhì)組學(xué)技術(shù),通過對氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠這一公認(rèn)的顳葉癲癇模型的海馬組織和腦皮質(zhì)中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行研究,建立顳葉癲癇大鼠海馬組織和腦皮質(zhì)蛋白質(zhì)的雙向熒光差異凝膠電泳圖譜,分析海馬和腦皮質(zhì)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化并最終鑒定差異蛋白,以進(jìn)一步探索TLE的發(fā)病機(jī)制,為尋找新的治療靶點提供依據(jù)。
　　 實驗方法:
　　 1.建立顳葉癲癇大鼠模型,成年健康雄性Wistar大鼠14只,體質(zhì)量200～250g,由山東大學(xué)實驗動物中心提供

4、。分為癲癇組8只,對照組6只。癲癇組給予氯化鋰127mg/kg腹腔注射,24h后腹腔注射匹魯卡品30mg/kg,在匹魯卡品注射前30min給予阿托品1mg/kg腹腔注射,以拮抗外周膽堿能效應(yīng)。出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)90 min后給予安定10mg/kg腹腔注射終止發(fā)作。對照組給予相同劑量的生理鹽水腹腔注射。
　　 2.采用雙向熒光差異凝膠電泳(two-dimensional fluorescence difference gelelec

5、trophoresis,2D-DIGE)技術(shù)分離大鼠海馬組織和腦皮質(zhì),Typhoon多功能激光掃描成像系統(tǒng)掃描凝膠,ImageMaster軟件分析圖像,篩選出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點。
　　 3.運用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laserdesorption/ionization time-of-flight mass spectro-metry,MALDI-TOF-MS)對差異蛋白質(zhì)點進(jìn)行分析

6、,獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprinting,PMF),利用Mascot軟件檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,確定差異蛋白質(zhì)。
　　 結(jié)果:
　　 1.顳葉癲癇大鼠模型:匹魯卡品致癇后按照Racine大鼠癲癇發(fā)作分級標(biāo)準(zhǔn)判定其發(fā)作程度,發(fā)作達(dá)到3～5級的大鼠視為誘導(dǎo)成功,表現(xiàn)為點頭、面部肌肉抽搐、肢體陣攣和跌倒等。癲癇組有兩只死亡,在實驗組中剔除。對照組無死亡。
　　 2.大鼠海馬組織經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)有

7、48個蛋白質(zhì)點存在表達(dá)差異,通過數(shù)據(jù)庫檢索最終確定19種差異蛋白質(zhì),其中13種表達(dá)上調(diào),6種表達(dá)下調(diào)。大鼠腦皮質(zhì)經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)43個蛋白質(zhì)點存在表達(dá)差異,通過數(shù)據(jù)庫檢索最終確定15種差異蛋白質(zhì),其中8種表達(dá)上調(diào),7種表達(dá)下調(diào)。
　　 3.對鑒定出的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分類,發(fā)現(xiàn)這些蛋白與神經(jīng)損傷、細(xì)胞骨架重塑、細(xì)胞代謝和氧化應(yīng)激等有關(guān),推測它們在TLE發(fā)病機(jī)理方面起著重要作用。
　　 結(jié)論:
　　 本實驗成功建立了顳葉癲癇