睡眠剝奪后海馬蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的:
　　睡眠在人類生活中占有很重要的位置。睡眠剝奪(sleep deprivation，SD)是指由于現(xiàn)代生活及工作上的需要、周圍環(huán)境或其他無法避免的原因而不能保證正常的睡眠。睡眠剝奪對人類認(rèn)知功能的影響是不容忽視的，包括清醒度、警覺性和注意力下降;學(xué)習(xí)記憶能力降低;執(zhí)行功能下降;負(fù)面情緒增加等。睡眠缺失引起的這些一系列認(rèn)知功能的障礙，與睡眠缺失導(dǎo)致腦部的某些重要的功能區(qū)域及有關(guān)其功能的蛋白質(zhì)的改變密切相關(guān)。睡眠缺失后可以在海

2、馬區(qū)觀察到很多變化如神經(jīng)元的更換、凋亡，樹突和突觸的重構(gòu)，在嚙齒類動物的前額葉皮層及杏仁核也可以觀察到其他一些適應(yīng)性改變。在睡眠剝奪后海馬神經(jīng)元有明顯損傷，神經(jīng)元形態(tài)的改變直接影響其正常生理功能的發(fā)揮，睡眠剝奪可引起大鼠海馬神經(jīng)元凋亡發(fā)生。海馬是位于腦顳葉內(nèi)的一個部位，它是組成大腦邊緣系統(tǒng)的一部分，擔(dān)當(dāng)著關(guān)于記憶以及空間定位的作用。海馬亦是老年期癡呆患者較早發(fā)生病理改變的部位。有研究認(rèn)為睡眠剝奪與很多神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)，而多種神經(jīng)退

3、行性疾病均發(fā)現(xiàn)有某些致病蛋白質(zhì)的聚集，由此可知，直接對睡眠剝奪后腦組織的蛋白質(zhì)組變化的研究可更加直觀的揭示其引起的機(jī)體各系統(tǒng)變化尤其是神經(jīng)系統(tǒng)改變的病理生理機(jī)制。
　　蛋白質(zhì)是生物體基因功能活動的最終執(zhí)行者，并直接體現(xiàn)生命現(xiàn)象的復(fù)雜性以及多樣性。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的興起是進(jìn)入后基因組時代的標(biāo)志，它是從整體的角度來研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯后修飾、蛋白與蛋白之間的作用等，并揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命現(xiàn)象之間的規(guī)律。差異蛋

4、白質(zhì)組學(xué)則是分析不同生物體在不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，為探索細(xì)胞的分子機(jī)制、疾病的病理病因及尋找治療藥物靶點提供了可能性的依據(jù)。
　　本研究通過對大鼠睡眠剝奪模型的制作，對正常對照組海馬組織和睡眠剝奪72小時后海馬組織進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，找出表達(dá)不同的蛋白質(zhì)，從而探尋睡眠剝奪后引起一系列的蛋白質(zhì)改變，從而幫助我們進(jìn)一步深入理解這些蛋白質(zhì)改變引起一系列疾病的本質(zhì)。
　　方法:
　　1、實驗分組:成年雄性Wistar

5、大鼠分為實驗組和對照組，實驗組大鼠進(jìn)行72小時睡眠剝奪，對照組大鼠維持正常睡眠-覺醒周期。
　　2、制作大鼠睡眠剝奪模型，實驗組大鼠于睡眠剝奪72小時后處死，斷頭取腦，分離大腦海馬組織;對照組同樣取相應(yīng)部位腦組織，將組織放EP管中后置于-80℃冰箱中備用。
　　3、進(jìn)行大鼠海馬組織蛋白質(zhì)提取并使用胰蛋白酶酶解脫鹽后待用。
　　4、將制備好的樣品肽段用TMT標(biāo)記，上樣buffer溶解，膠條水化，并經(jīng)TFA酸化后進(jìn)行C18

6、 Zip-Tip脫鹽。
　　5、抽干樣品后溶解、離心，并用LC-LTQ-MS/MS分析以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索。
　　結(jié)果:
　　1、成功制作大鼠睡眠剝奪模型，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)及TMT技術(shù)，比較睡眠剝奪72小時組與正常對照組海馬蛋白質(zhì)的變化，得出差異蛋白99個，其中表達(dá)上調(diào)的蛋白有65個，表達(dá)下調(diào)的蛋白有34個。
　　2、運(yùn)用GeneCodis軟件分析發(fā)現(xiàn)有意義的蛋白60多個，這些蛋白主要涉及到蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及降解、突觸再生、

7、氧化應(yīng)激、細(xì)胞周期、能量代謝與細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程。
　　結(jié)論:
　　1、運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)及TMT標(biāo)記技術(shù)鑒定出大鼠睡眠剝奪后與對照組海馬組織相比差異表達(dá)蛋白涉及蛋白質(zhì)加工與降解、突觸再生及其功能、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡過程等等，而這些過程多數(shù)與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病尤其是AD發(fā)生的病理機(jī)制密切相關(guān)，提示睡眠缺失與腦老化及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病可能存在潛在的聯(lián)系。從而幫助我們進(jìn)一步深入理解這些疾病的本質(zhì)。
　　2、通過本實驗表明