家蠶膜蛋白BmOcular alb的表達與純化研究.pdf

1、Ocular alb超家族蛋白屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)類似蛋白,是一類可以與異三聚體G蛋白結合的膜蛋白,但與典型的GPCR不同的是Ocular alb超家族蛋白一般不存在于細胞膜而是存在于胞內(nèi)細胞器(主要是黑色素小體和溶酶體)質(zhì)膜,該家族在人體及小鼠體內(nèi)與眼白化病的產(chǎn)生相關,但在其他物種內(nèi)的具體作用機制不詳。
　　 本研究從家蠶cDNA文庫中,選取一個編碼具有Ocular alb超家族蛋白保守序列的基因,命名為BmOcul

2、ar_alb(BmOA)。該基因在GenBank登錄號為：DY230641。BmOcular alb蛋白由453 bp核苷酸序列編碼的150個氨基酸殘基組成,經(jīng)生物信息學分析,該蛋白含有兩個跨膜區(qū),分子量為17.7 kD,等電點為9.94。將BmOA基因克隆到pBacPAK8-Ph-tev(Ph為多角體基因,編碼29 kD大小的蛋白,tev為TEV酶切位點編碼基因)質(zhì)粒中,獲得重組質(zhì)粒pBacPAK8-Ph-tev-BmOA,經(jīng)BamH

3、Ⅰ和NotⅠ雙酶切后,將Ph-tev-BmOA插入原核表達載體pET-28a中,構建重組表達質(zhì)粒,并轉化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)。轉化工程菌后以IPTG誘導表達后經(jīng)SDS-PAGE分析及Western blotting檢測,確定了融合蛋白Ph-tev-BmOA的表達。由于含有多角體的融合蛋白與天然多角體具有相同的特性,利用多角體的特性純化該融合蛋白,通過簡單的純化方法(反復調(diào)節(jié)pH值)達到純化融合蛋白的目的。同時,成功的構建了重

4、組pFastBacHTB-Ph-tev-BmOA質(zhì)粒,通過Bac-to-Bac系統(tǒng),成功構建了重組桿狀病毒Bacmid-Ph-tev-BmOA;重組桿狀病毒基因組通過脂質(zhì)體介導法轉染家蠶BmN細胞,獲得了表達多角體融合蛋白的發(fā)病細胞,并在發(fā)病細胞中發(fā)現(xiàn)融合蛋白表達。為了分析BmOA基因的功能,進一步研究BmOA蛋白在家蠶中的作用,我們進行了熒光定量PCR,發(fā)現(xiàn)該基因在家蠶五齡幼蟲的氣門中的轉錄量最高。我們通過RNAi實驗初步探索了,Bm