家蠶Dorsal的表達(dá)純化及激活研究.pdf

1、家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，在養(yǎng)殖過(guò)程中容易受到病原微生物的感染引發(fā)蠶病，給桑蠶業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，家蠶抗病等免疫機(jī)制的深入研究非常迫切。家蠶依賴其先天免疫系統(tǒng)抵抗病原微生物的侵染，抗菌肽(AMP)的產(chǎn)生是家蠶的主要免疫應(yīng)答反應(yīng)?？咕闹饕蒊MD(immune deficiency)途徑和Toll途徑產(chǎn)生，Rel/NF-κB是兩種途徑中的轉(zhuǎn)錄因子，作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)子來(lái)調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因。在果蠅體內(nèi)，作用于Toll途徑的Rel/NF-κB轉(zhuǎn)

2、錄因子Dorsal被真菌和革蘭氏陽(yáng)性菌激活。Dorsal在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與Cactus相互作用，當(dāng)受到免疫刺激時(shí)，Dorsal與Cactus分離進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而產(chǎn)生抗菌肽。在家蠶體內(nèi)，目前沒(méi)有直接證據(jù)證明Dorsal作用于Toll途徑，在受到病原菌感染后是否從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核還不清楚。
　　本研究中以家蠶為模式生物，克隆Dorsal基因，構(gòu)建原核表達(dá)菌株并表達(dá)、純化Dorsal蛋白，制各家蠶Dorsal抗體。選取了革蘭氏陽(yáng)性菌黑胸?cái)⊙?/p>

3、Bacillusbombysepticus和革蘭氏陰性菌假結(jié)核耶爾森氏菌Yersinia pseudotuberculosis、大腸桿菌Escherichia coli分別注射感染家蠶，取感染后12h、24h脂肪體細(xì)胞進(jìn)行核質(zhì)蛋白提取，分別檢測(cè)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中Dorsal蛋白的含量變化及蛋白分子量，通過(guò)其含量變化和分子量的變化推測(cè)Dorsal的激活、轉(zhuǎn)運(yùn)。選取了革蘭氏陽(yáng)性菌黑胸?cái)⊙透锾m氏陰性菌大腸桿菌注射感染家蠶，檢測(cè)Attacti

4、n2，CercropinE，Lebocin，Gloverin3，Moricin五種抗菌肽表達(dá)量的變化是否與Dorsal蛋白的變化一致。結(jié)果如下:
　　(1)利用大腸桿菌表達(dá)家蠶Dorsal蛋白，獲得家蠶Dorsal抗體。
　　(2)提取感染后的家蠶脂肪體細(xì)胞核質(zhì)蛋白，用Dorsal抗體檢測(cè)核質(zhì)內(nèi)Dorsal蛋白，發(fā)現(xiàn)感染12h時(shí)，Dorsal蛋白可能以二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞核中并未檢測(cè)到Dorsal蛋白;24h時(shí)，

5、細(xì)胞質(zhì)中Dorsal被激活，在蛋白水平發(fā)生改變，并且在受到細(xì)菌感染后部分活化的Dorsal蛋白由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)后進(jìn)入細(xì)胞核，感染革蘭氏陽(yáng)性菌后轉(zhuǎn)運(yùn)效果更明顯。
　　(3)利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，家蠶在感染黑胸?cái)⊙痛竽c桿菌后，Attactin2，CercropinE，Lebocin，Gloverin3，Moricin在家蠶脂肪體中的表達(dá)水平均有顯著上升，說(shuō)明家蠶感染病原菌后會(huì)激活抗菌肽的表達(dá)。
　　結(jié)果表明:家蠶感染細(xì)菌2