家蠶Dorsal的表達(dá)純化及激活研究.pdf

1、家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，在養(yǎng)殖過程中容易受到病原微生物的感染引發(fā)蠶病，給桑蠶業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，家蠶抗病等免疫機(jī)制的深入研究非常迫切。家蠶依賴其先天免疫系統(tǒng)抵抗病原微生物的侵染，抗菌肽(AMP)的產(chǎn)生是家蠶的主要免疫應(yīng)答反應(yīng)?？咕闹饕蒊MD(immune deficiency)途徑和Toll途徑產(chǎn)生，Rel/NF-κB是兩種途徑中的轉(zhuǎn)錄因子，作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)子來調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因。在果蠅體內(nèi)，作用于Toll途徑的Rel/NF-κB轉(zhuǎn)

2、錄因子Dorsal被真菌和革蘭氏陽性菌激活。Dorsal在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與Cactus相互作用，當(dāng)受到免疫刺激時，Dorsal與Cactus分離進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而產(chǎn)生抗菌肽。在家蠶體內(nèi)，目前沒有直接證據(jù)證明Dorsal作用于Toll途徑，在受到病原菌感染后是否從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核還不清楚。
　　本研究中以家蠶為模式生物，克隆Dorsal基因，構(gòu)建原核表達(dá)菌株并表達(dá)、純化Dorsal蛋白，制各家蠶Dorsal抗體。選取了革蘭氏陽性菌黑胸敗血菌

3、Bacillusbombysepticus和革蘭氏陰性菌假結(jié)核耶爾森氏菌Yersinia pseudotuberculosis、大腸桿菌Escherichia coli分別注射感染家蠶，取感染后12h、24h脂肪體細(xì)胞進(jìn)行核質(zhì)蛋白提取，分別檢測細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中Dorsal蛋白的含量變化及蛋白分子量，通過其含量變化和分子量的變化推測Dorsal的激活、轉(zhuǎn)運。選取了革蘭氏陽性菌黑胸敗血菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌注射感染家蠶，檢測Attacti

4、n2，CercropinE，Lebocin，Gloverin3，Moricin五種抗菌肽表達(dá)量的變化是否與Dorsal蛋白的變化一致。結(jié)果如下:
　　(1)利用大腸桿菌表達(dá)家蠶Dorsal蛋白，獲得家蠶Dorsal抗體。
　　(2)提取感染后的家蠶脂肪體細(xì)胞核質(zhì)蛋白，用Dorsal抗體檢測核質(zhì)內(nèi)Dorsal蛋白，發(fā)現(xiàn)感染12h時，Dorsal蛋白可能以二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞核中并未檢測到Dorsal蛋白;24h時，

5、細(xì)胞質(zhì)中Dorsal被激活，在蛋白水平發(fā)生改變，并且在受到細(xì)菌感染后部分活化的Dorsal蛋白由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運后進(jìn)入細(xì)胞核，感染革蘭氏陽性菌后轉(zhuǎn)運效果更明顯。
　　(3)利用實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，家蠶在感染黑胸敗血菌和大腸桿菌后，Attactin2，CercropinE，Lebocin，Gloverin3，Moricin在家蠶脂肪體中的表達(dá)水平均有顯著上升，說明家蠶感染病原菌后會激活抗菌肽的表達(dá)。
　　結(jié)果表明:家蠶感染細(xì)菌2