多角體融合的家蠶表皮膜蛋白N141的高效表達(dá)與純化.pdf

1、膜蛋白是生物膜功能的主要承擔(dān)者,其結(jié)構(gòu)、功能的研究對(duì)了解認(rèn)識(shí)膜蛋白起著至關(guān)重要的作用,而研究的前提是純化膜蛋白。由于膜蛋白一般整合在生物膜上,同時(shí)表達(dá)量又十分有限,往往難以分離純化。本論文研究將多角體蛋白基因與膜蛋白基因分別在大腸桿菌和家蠶細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高效融合表達(dá)并開展純化研究。
　　 本研究從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶跨膜蛋白序列cDNA文庫(kù)中篩選獲得一條cDNA序列,將其命名為N141。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白含有保守結(jié)構(gòu)

2、域chitin_bind_4,該序列含有一435 bp的開放閱讀框,預(yù)測(cè)編碼144個(gè)氨基酸殘基,編碼蛋白質(zhì)分子量大小為16.9kDa,有一個(gè)跨膜區(qū)。根據(jù)其ORF框設(shè)計(jì)上下游引物,PCR擴(kuò)增目的基因并克隆到載體pBacPAK8-Polh中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pBacPAK8-Polh-N141。用BamH I和EcoR I雙酶切上述重組質(zhì)粒,將Polh-N141基因片段克隆到載體pET-28a的相應(yīng)酶切位點(diǎn),成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-Po

3、lh-N141。用IPTG誘導(dǎo)含重組質(zhì)粒的工程菌表達(dá),裂解菌液經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting分析鑒定發(fā)現(xiàn)融合蛋白高效表達(dá)且主要以包涵體的形式存在于沉淀中。利用多角體蛋白基因強(qiáng)啟動(dòng)子特性,使得融合蛋白Polh-N141高效表達(dá)。利用多角體蛋白的溶解度特性,通過梯度pH洗滌法即梯度pH值的Tris·Cl緩沖液洗滌沉淀來純化融合蛋白。純化的融合蛋白經(jīng)Western blotting和肽指紋圖譜證實(shí)該蛋白為帶有多聚組氨酸標(biāo)

4、簽的融合蛋白。將純化的融合蛋白用TEV酶切去除多角體,以純化膜蛋白N141。利用多角體蛋白的相關(guān)性質(zhì),使膜蛋白大量表達(dá)且便捷純化。同時(shí),利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),將Polh-N141基因片段克隆到載體pFastBacHTb,構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBac-Polh-N141并轉(zhuǎn)化DH10Bac E.coli,與家蠶桿狀病毒基因組Bacmid發(fā)生轉(zhuǎn)座,得到重組桿狀病毒基因組并轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞BmN以獲取重組桿狀病毒vPolh-N