梅毒螺旋體膜蛋白的表達(dá)、純化及其免疫活性的研究.pdf

1、研究背景及目的
　　 梅毒螺旋體膜蛋白在細(xì)胞間接觸、表面識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶活性和運(yùn)輸?shù)确矫娑及缪葜匾慕巧?，通過(guò)對(duì)梅毒螺旋體重組抗原的研究有利于鑒別并篩選可用于梅毒早期實(shí)驗(yàn)室診斷及疫苗研制的候選抗原，同時(shí)對(duì)于深入研究梅毒的發(fā)病機(jī)制、了解在梅毒螺旋體感染過(guò)程中宿主．病原菌的相互關(guān)系，具有重要意義。然而，資料表明，對(duì)梅毒螺旋體膜蛋白的研究一直較為困難，研究結(jié)果也存在著爭(zhēng)議，為此我們利用基因工程技術(shù)，采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，分別對(duì)Tp

2、0965、Tp0136及Tp0608三種蛋白進(jìn)行表達(dá)，對(duì)表達(dá)出的蛋白進(jìn)行相關(guān)免疫活性的檢測(cè)，并探討重組蛋白Tp0965作為包被抗原建立間接ELISA的方法應(yīng)用于梅毒診斷的可行性。
　　 研究方法
　　 使用Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株接種家兔睪丸，制備Tp Nichols菌株DNA，PCR擴(kuò)增Tp0965、Tp0608基因，Tp0136基因采用全基因合成的方法；構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a/Tp0965、Tp0136及Tp0

3、608，分別進(jìn)行BamHI/SaI1、BamHI/HindⅢ及NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確后大腸桿菌轉(zhuǎn)化，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE和Western blot鑒定，并純化重組蛋白，BCA法檢測(cè)重組蛋白濃度。用純化的重組蛋白Tp0965、Tp0136免疫新西蘭兔，并以該重組蛋白作為包被抗原建立間接ELISA法以檢測(cè)免疫兔的多克隆抗體效價(jià)；Western blot檢測(cè)重組的Tp0965、Tp0136及Tp0608與梅毒陽(yáng)

4、性血清的免疫反應(yīng)。以重組蛋白Tp0965為包被抗原建立間接ELISA檢測(cè)各期梅毒患者血清。
　　 研究結(jié)果
　　 (1)成功構(gòu)建目的基因與E．coli表達(dá)質(zhì)粒載體pET28，成功表達(dá)和純化出具有較高純度和濃度的膜蛋白Tp0965、Tp0136及Tp0608。
　　 (2)用重組蛋白Tp0136免疫新西蘭兔，在免疫2周后即能檢測(cè)到抗體的產(chǎn)生，免疫3次后產(chǎn)生高效價(jià)抗體；而重組蛋白Tp0965只有在免疫3次以后，才能刺

5、激兔產(chǎn)生較低效價(jià)的抗體。
　　 (3)Western blot實(shí)驗(yàn)顯示三種重組蛋白Tp0965、Tp0136及Tp0608均能與梅毒陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，在電泳圖上有特異性條帶出現(xiàn)。
　　 (4)以重組蛋白Tp0965作為包被抗原建立間接ELISA診斷各期梅毒，陽(yáng)性率高達(dá)94.6％，而與梅毒陰性血清不能結(jié)合。
　　 結(jié)論
　　 (1)能夠通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)重組出具有全基因片段長(zhǎng)度的膜蛋白Tp0965、