梅毒螺旋體實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)

1、灌南縣第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科金建懷2016年6月17日,梅毒的實(shí)驗(yàn)室診斷,概述,梅毒及其病原學(xué)特征梅毒流行狀況梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷暗視野顯微鏡檢查及臨床意義梅毒血清學(xué)檢查及臨床意義梅毒檢測(cè)試劑評(píng)估梅毒診斷標(biāo)準(zhǔn)知識(shí)要點(diǎn)與報(bào)告要求,梅毒及其病原學(xué)特征,梅毒 syphilis,梅毒（syphilis）是由梅毒螺旋體（treponema pallidum）引起的主要通過性接觸或血液傳播，侵犯多系統(tǒng)多臟器的全身性慢性傳染病。臨床癥狀

2、復(fù)雜,時(shí)隱時(shí)現(xiàn)傳染途徑:性傳播,垂直傳播,其它途徑,梅毒螺旋體特征,有6～12個(gè)規(guī)則的螺旋螺旋整齊，數(shù)目固定折光性強(qiáng)，較其他螺旋體亮運(yùn)動(dòng)緩慢而有規(guī)律，有三種運(yùn)動(dòng)方式圍繞其長(zhǎng)軸旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)伸縮其螺旋間距離移動(dòng)彎曲扭動(dòng)如蛇行,暗視野梅毒螺旋體,梅毒螺旋體,熒光法檢查梅毒螺旋體,梅毒螺旋體特征,人是梅毒螺旋體的唯一自然宿主梅毒螺旋體不能在體外培養(yǎng)繁殖最適生存溫度是37℃，離開人體很快死亡 ● 梅毒螺旋體屬厭氧微生物，耐寒能

3、力強(qiáng)。煮沸、干燥、肥皂水及一般消毒劑均可短期內(nèi)將其殺死,梅毒螺旋體致病性,致病物質(zhì)：莢膜樣物質(zhì)、粘多糖酶所致疾病——梅毒后天梅毒－－經(jīng)性接觸傳染 臨床分期 一期梅毒：外生殖器硬性下疳 二期梅毒：全身梅毒疹 三期梅毒：皮膚粘膜潰瘍、侵犯內(nèi)臟器官或組織 隱性梅毒：無任何梅毒性的癥狀和體征先天梅毒－－經(jīng)胎盤傳給胎兒 胎兒表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎 出生后表現(xiàn)為鋸齒形牙、鞍形鼻等,2

4、010年全國(guó)梅毒疫情地區(qū)分布,發(fā)病率位于前5位：浙江：97.13/10萬廣西：82.58/10萬上海：75.93/10萬福建：58.23/10萬新疆：52.97/10萬,2010年全國(guó)梅毒疫情年齡與性別分布,男女性別比：0.94︰115-39歲：女性多于男性40歲以上：男性多于女性,,標(biāo)本采集部位：皮膚或粘膜損害 有痂者去痂，先用無菌棉球或紗布蘸生理鹽水，將皮損拭凈，輕壓皮損至滲液（避免出血）。然后用載玻片印取滲液，

5、立即檢查，未破潰者用手術(shù)刀刮破皮疹，取滲出液。淋巴結(jié)穿刺液 以無菌操作法用注射器吸取0.25-0.5ml生理鹽水，穿刺入淋巴結(jié)，再回吸2～3次，最后將吸取液涂玻片上，立即檢查。,梅毒暗視野采樣,,,暗視野顯微鏡檢查,制片 標(biāo)本置于載玻片上，加一滴生理鹽水，蓋上蓋玻片，在暗室中于暗視野顯微鏡上油鏡觀察觀察先用低倍鏡，再轉(zhuǎn)至高倍鏡梅毒螺旋體在暗背景上呈白色發(fā)光，螺旋整齊，運(yùn)動(dòng)規(guī)律（旋轉(zhuǎn)、伸縮或蛇行運(yùn)動(dòng)）,暗視野顯微鏡檢查,結(jié)

6、果解釋—陽性暗視野顯微鏡查陽性，臨床上可確診梅毒特別對(duì)一期梅毒硬下疳，腫大淋巴結(jié)，二期梅毒皮膚粘膜損害的診斷有重要價(jià)值，尤其使用于早期梅毒血清學(xué)陰性時(shí),暗視野顯微鏡檢查,結(jié)果解釋—陰性陰性結(jié)果不能排除梅毒螺旋體數(shù)量不足已用過抗生素或某些外用藥 損害接近自然消退損害不是梅毒檢驗(yàn)人員技術(shù),暗視野顯微鏡檢查,特點(diǎn)該方法具有快速、方便、可靠的特點(diǎn)，已被WHO確定為性病實(shí)驗(yàn)室必備項(xiàng)目之一口腔中含有其他密螺旋體，與梅毒螺旋體

7、不易區(qū)別，暗視野顯微鏡查不推薦于口腔皮損材料,梅毒血清學(xué)檢查,血清學(xué)方法是診斷各期梅毒的主要方法，包括：非特異性血清學(xué)試驗(yàn)（非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)） 用于初篩試驗(yàn)、療效觀察。特異性血清學(xué)試驗(yàn)（梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)） 用于確證試驗(yàn)，對(duì)療效觀察意義不大。局限性：非常早期的梅毒可能出現(xiàn)陰性，還需做病原體檢查。,國(guó)內(nèi)梅毒血清學(xué)試驗(yàn)的傳統(tǒng)程序是：先以非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)（如RPR、TRUST、VDRL等）進(jìn)行初篩，再以梅

8、毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)（如TPPA、TPHA、FTA-ABS等）進(jìn)行確認(rèn)。美國(guó)、法國(guó)和比利時(shí)也采用類似的程序。該程序的優(yōu)點(diǎn)是排除了大多數(shù)感染過梅毒但經(jīng)過充分治療的病人，從而使臨床更易決定是否需要進(jìn)行抗梅治療。,將梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)和非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)組合在一起（如RPR+TPHA或TPPA）作為初篩試驗(yàn)可以最大限度地檢出各期梅毒病例（除一期梅毒的極早期），同時(shí)保證了敏感性和特異性，是最為理想的梅毒初篩方案。這是世界衛(wèi)生組織

9、（WHO）推薦的方案，英國(guó)等一些歐洲國(guó)家也已采用多年。其缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，實(shí)驗(yàn)室的工作量較大。,梅毒的確認(rèn)必須采用特異性梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)，最常用的是TPPA或TPHA，也可采用ELISA。FTA-ABS仍被認(rèn)為是梅毒血清學(xué)測(cè)定的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但使用上有很大限制。多數(shù)實(shí)驗(yàn)室無法常規(guī)開展，因此一般只用于對(duì)有爭(zhēng)議標(biāo)本的檢測(cè)。如果僅使用非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)進(jìn)行初篩，則可以用任意一種梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)做確認(rèn)；如果在初篩時(shí)已使用了梅毒

10、螺旋體抗原血清試驗(yàn)，則可以考慮選用另一方法學(xué)的梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)（例如在初篩時(shí)使用了TPPA或TPHA，則可用ELISA進(jìn)行確認(rèn)，反之亦然）。,非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn),本法主要檢測(cè)抗梅毒螺旋體細(xì)胞膜上脂類的IgG和IgM抗體。 原理：人體感染梅毒螺旋體后，組織破壞所釋放的類脂，與梅毒螺旋體結(jié)合后形成完全抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生類脂質(zhì)抗體（反應(yīng)素）。主要為IgG，IgM的混合抗體,非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn),已知抗原：心磷脂、卵

11、磷脂及膽固醇檢測(cè)成分：血清梅毒反應(yīng)素方法：性病研究實(shí)驗(yàn)室玻片試驗(yàn)（VDRL）血清不需加熱的反應(yīng)素玻片試驗(yàn)（USR）快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR）甲苯胺紅血清不需加熱試驗(yàn)（TRUST）,RPR/TRUST,原理:RPR:以黑色的炭顆粒作為指示標(biāo)記物TRUST:以紅色的甲苯胺紅顆粒作為指示標(biāo)記物檢測(cè)成分：血清梅毒反應(yīng)素,,,,,,RPR/TRUST,定性試驗(yàn)在紙卡圓圈中加入50μL待檢血清，涂滿整個(gè)圓圈使用滴管和

12、專用針頭，加1滴混勻的抗原懸液旋轉(zhuǎn)100rpm，8min立即判斷結(jié)果,,,RPR/TRUST,結(jié)果判斷陽性：在圓圈中見不規(guī)則大小黑色/紅色凝集塊陰性：在圓圈中無黑色/紅色凝集塊，僅見黑色/紅色顆粒集于中央一點(diǎn)或均勻分散。,非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： *敏感性特異性好 *不需要昂貴設(shè)備，簡(jiǎn)單易行 *適用于大量人群的血清篩查 *有效治療后血清滴度可下降

13、并陰轉(zhuǎn)，故可作療效觀察、判愈、復(fù)發(fā)。 *20分鐘可獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 *試劑與方法均已標(biāo)化，各實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果可比較。 *試驗(yàn)可被內(nèi)部質(zhì)控和外部質(zhì)控監(jiān)控進(jìn)行。缺點(diǎn)： *敏感性和特異性低于螺旋體抗原試驗(yàn)，BFP反應(yīng)和前帶現(xiàn)象,,渾濁,（定性）,RPR/TRUST,定量試驗(yàn)待檢血清用等滲鹽水在紙卡圓圈中作梯度稀釋：原血清，1:2，1:4，1:8，1:16，1:3

14、2……按定性試驗(yàn)步驟操作，以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋度報(bào)告結(jié)果,,,,（倍比稀釋）,RPR/TRUST,注意事項(xiàng)：實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度應(yīng)為：23-29 ℃抗原應(yīng)保存于4 ℃冰箱，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)恢復(fù)到室溫。抗原應(yīng)防止凍結(jié)。血液標(biāo)本實(shí)驗(yàn)前應(yīng)恢復(fù)到室溫，并在24小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)。試驗(yàn)完畢應(yīng)立即觀察結(jié)果。,RPR/TRUST,假陰性有25%-40%的未治療梅毒在晚期隱性期可自然逆轉(zhuǎn)為陰性，約30%的心血管和神經(jīng)梅毒呈陰性前帶現(xiàn)象：抗原抗體量比例不

15、適，抑制陽性反應(yīng)。一般易發(fā)生在滴度在1：500以上的標(biāo)本中。 1%的II期梅毒會(huì)出現(xiàn)前帶現(xiàn)象操作人員應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)的溫度，試劑盒從冰箱取出后應(yīng)恢復(fù)至室溫，室溫過低（〈10℃）可能出現(xiàn)假陰性或結(jié)果不準(zhǔn)確（即使出陽性結(jié)果，試驗(yàn)滴度也不準(zhǔn)）。,RPR/TRUST,生物學(xué)假陽性：急性或慢性傳染?。猴L(fēng)疹、麻疹、水痘、瘧疾、上呼吸道感染、病毒性肝炎，活動(dòng)性肺結(jié)核、麻風(fēng)，肺炎球菌性肺炎等；②其它疾?。篠LE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)心病、DLE、肝硬化、

16、慢性腎炎、系統(tǒng)性硬化癥、自身免疫性溶血性貧血等；③身體狀況改變：麻醉劑成癮、妊娠、年老等一般假陽性血清抗體滴度<1：8應(yīng)排除技術(shù)性、生理性和生物學(xué)假陽性，并用特異性試驗(yàn)來證實(shí),梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn),已知抗原：梅毒螺旋體抗原檢測(cè)成分：抗梅毒螺旋體抗體方法： 1.熒光螺旋體抗體吸收試驗(yàn)（FTA-ABS） 2.梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)（TPHA） 3.梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA） 4.梅毒

17、螺旋體ELISA試驗(yàn) 5.快速試驗(yàn)（膠體金）,TPPA,原理：用整菌和其片斷做抗原致敏的明膠顆粒，此致敏顆粒與人血清或血漿中的梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見的凝集反應(yīng)敏感性和特異性均高敏感性：一期梅毒：70%-100%， 二期梅毒：100% 三期梅毒95%-98%特異性：94%-100%容許做梅毒的精確診斷,TPPA,原理示意圖,,明膠顆粒,,抗原,TPPA,材料U型板 、微量

18、加樣器（25ul）、振蕩器TPPA試劑盒(溶解液，樣本稀釋液, 致敏顆粒, 非致敏顆粒,質(zhì)控血清,專用滴管）,方法,TPPA,結(jié)果判斷陰性(－):顆粒沉積在孔底,周邊平滑,或形成致密圓圈 可疑反應(yīng)(±):明膠顆粒沉積在孔底,中央形成致密小環(huán), 周邊平滑陽性(+/++):內(nèi)有清晰的寬環(huán)且外緣粗糙強(qiáng)陽性(+++/ ++++):孔內(nèi)凝聚顆粒形成均一的膜覆蓋在整

19、 個(gè)孔底者孔內(nèi)樣品與致敏和非致敏顆粒均產(chǎn)生凝集者,則需作重吸收試驗(yàn)后進(jìn)一步檢測(cè),,,,TPPA,,TPPA,,TPPA,注意事項(xiàng)①專用滴管應(yīng)標(biāo)明不能混用，不能用來稀釋血清。②未致敏孔不發(fā)生凝集，否則試驗(yàn)無效。如果標(biāo)本與非致敏和致敏顆粒均產(chǎn)生凝集，需作重吸收試驗(yàn)。③反應(yīng)板要清潔干凈，孔內(nèi)無異物。④試劑保存于2~10℃，不可凍結(jié)，不同批號(hào)試劑間不可混用,其它常用確證方法,梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELIS

20、A）快速檢測(cè)試劑（膠體金）,梅毒血清學(xué)檢查臨床意義,非特異性血清學(xué)試驗(yàn)陽性可能表示：現(xiàn)癥感染、接受或未接受過治療的近期感染可用于療效觀察、判愈、判定復(fù)發(fā)及再感染 早期梅毒患者經(jīng)充分治療后，滴度逐漸下降，半年到2年大部分非特異性血清學(xué)試驗(yàn)陰轉(zhuǎn)可能有生物學(xué)假陽性(滴度常<1:8）適用于人群篩查、產(chǎn)前檢查及健康體檢,梅毒血清學(xué)檢查臨床意義,特異性血清學(xué)試驗(yàn)陽性結(jié)果表示現(xiàn)癥感染接受或末接受過治療的近期感染既往曾經(jīng)感染

21、特異性血清學(xué)試驗(yàn)因其敏感性高，特異性強(qiáng)，可作為證實(shí)試驗(yàn)及排除假陽性。特別是隱性梅毒及一些非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)陰性而又懷疑為梅毒的患者。在多數(shù)情況下，一旦感染了梅毒，特異性血清學(xué)試驗(yàn)抗體陽性可保持?jǐn)?shù)年，甚至終生陽性，故定性的特異性血清學(xué)試驗(yàn)不能用于觀察療效、判斷復(fù)發(fā)及再感染。,梅毒血清學(xué)檢查臨床意義,梅毒感染的較早期，機(jī)體尚未產(chǎn)生抗體，非特異性血清學(xué)試驗(yàn)和特異性血清學(xué)試驗(yàn)均可陰性，需追蹤觀察。,試驗(yàn)結(jié)果RPR+,TPPA-RPR

22、+,TPPA+RPR-, TPPA+RPR-, TPPA-,RPR假陽性,現(xiàn)癥梅毒，治愈的晚期梅毒,極早期梅毒，治愈的早期梅毒,排除梅毒感染,意義,極早期梅毒（尚無任何抗梅毒抗體產(chǎn)生）,常見結(jié)果分析,常見結(jié)果分析,常見結(jié)果分析,檢測(cè)策略,檢測(cè)策略,梅毒檢測(cè)試劑評(píng)估結(jié)果,梅毒螺旋體抗體檢測(cè)試劑評(píng)估結(jié)果,非梅毒螺旋體抗體檢測(cè)試劑評(píng)估結(jié)果,梅毒診斷標(biāo)準(zhǔn)知識(shí)要點(diǎn),梅毒診斷標(biāo)準(zhǔn),梅毒診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)衛(wèi)生部衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《梅毒診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS273－

23、2007)。梅毒診斷分為一期、二期、三期、隱性和胎傳梅毒。梅毒診斷原則應(yīng)根據(jù)流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查等進(jìn)行綜合分析。,梅毒診斷標(biāo)準(zhǔn),,梅毒經(jīng)充分治療后，應(yīng)隨訪2－3年。第一年每3個(gè)月復(fù)查一次，以后每半年復(fù)查一次，包括臨床和血清（非螺旋體抗原試驗(yàn)）。如在治療后6個(gè)月內(nèi)血清滴度未有4倍（即2個(gè)稀釋度）下降，應(yīng)視為治療失敗，或再感染，除需加倍重新治療外，還應(yīng)考慮是否需要作腦脊液檢查，以觀察神經(jīng)系統(tǒng)有無梅毒感染。一期梅毒在1年以內(nèi)、二期