重組梅毒螺旋體抗原TpN17的純化及基于金磁微粒梅毒螺旋體抗體的檢測(cè).pdf

1、梅毒是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病之一，其病原體為梅毒螺旋體(Treponema pallidum，Tp)。血清梅毒抗體水平是診斷梅毒螺旋體感染的主要指標(biāo)，傳統(tǒng)方法包括性病實(shí)驗(yàn)室研究試驗(yàn)、熒光螺旋體吸收試驗(yàn)和梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)等。近年來，以酶標(biāo)板為載體的梅毒螺旋體IgM和IgG抗體的檢測(cè)已被用于臨床檢驗(yàn)和血站血液篩查。本研究工作包括兩個(gè)部分：1．梅毒螺旋體抗原TpN17在畢赤酵母中的表達(dá)與純化。2．以金磁微粒為載體，利用純化得到的TpN

2、17抗原和市售梅毒螺旋體混合抗原(TpN15，TpN17，TpN47)建立針對(duì)梅毒螺旋體抗體的雙抗原夾心檢測(cè)方法。 通過甲醇誘導(dǎo)，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組梅毒螺旋體抗原TpN17，樣品經(jīng)飽和硫酸銨沉淀粗提后，以陽離子層析交換柱對(duì)表達(dá)的TpNl7進(jìn)行進(jìn)一步純化。結(jié)果表明，樣品經(jīng)硫酸銨沉淀、PB復(fù)溶后以陽離子交換層析柱進(jìn)行純化，NaCl濃度梯度洗脫，可獲得純度大于90％的重組梅毒螺旋體抗原TpN17。Bradford法測(cè)定蛋白濃度

3、為0.66 mg/mL。用過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記到抗原TpN17上，雙抗原夾心法測(cè)定HRP-TpNl7滴度為1：3,200，作為包被的TpN17和標(biāo)記抗原HR：P-TpN17可用于梅毒螺旋體抗體的檢測(cè)。 金磁微粒(Fe<,3>O<,4>/Au)是結(jié)合磁性氧化物粒子和膠體金特點(diǎn)的新型磁性復(fù)合微粒，組裝結(jié)構(gòu)的金磁微粒具有磁性Fe<,3>O<,4>核，表面組裝有大量納米級(jí)金粒子，集膠體金對(duì)生物分子的快速固定化和磁性納

4、米粒子在外磁場(chǎng)可分離性于一體，在免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。利用雙抗原夾心法原理，以純化得到的TpN17和標(biāo)記抗原HRP-TpN17，初步建立了基于金磁微粒的梅毒螺旋體抗體的檢測(cè)方法。金磁微粒表面形成夾心復(fù)合物后以3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺底物顯色，磁性分離后測(cè)定上清液在450 nm處吸光度值。結(jié)果表明，在固定抗原量為480 ng/管、HRP-標(biāo)記抗原稀釋度為1：1，600時(shí)，陽性血清的檢測(cè)值可達(dá)1．7以上，對(duì)已確診患者血清

5、樣本的檢測(cè)表明，該方法的陽性檢出率為93.3％，還存在6.7％的漏檢率，說明方法的靈敏度和特異性還有待改進(jìn)。為完善以金磁微粒為載體檢測(cè)梅毒抗體的方法，采用市售的重組梅毒螺旋體混合抗原(TpN47，Tpy17，TpN15)對(duì)梅毒螺旋體抗體進(jìn)行檢測(cè)。將固定有混合抗原的金磁微粒與血清(或血漿)及HRP-標(biāo)記混合抗原在37℃溫育30 min后以3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺底物顯色，磁性分離后測(cè)定上清液在450 nm處吸光度值。對(duì)方法的臨界值