梅毒螺旋體的基因分型與臨床耐藥及診斷研究.pdf

1、背景：據(jù)WHO估計(jì)，近年來全世界每年約有1,060萬梅毒新發(fā)病例。我國梅毒的報(bào)告感染率和發(fā)病率也呈直線上升趨勢，2015年度全國梅毒報(bào)告發(fā)病數(shù)為458,682例，較2011年增長16％。因此，對(duì)梅毒進(jìn)行有效的監(jiān)控及防治已成為我國乃至全球公共衛(wèi)生普遍關(guān)注的重點(diǎn)。
　　對(duì)梅毒螺旋體（Treponema pallidum,Tp）進(jìn)行基因分型不僅能揭示梅毒傳播的規(guī)律，還能從分子水平區(qū)分不同的菌株型別，判定梅毒患者的感染狀態(tài)，了解不同型別與

2、特定臨床癥狀的關(guān)系。當(dāng)前，各國學(xué)者普遍采用的梅毒分型方法是arp/tpr/tp0548三基因分型法，該分型系統(tǒng)穩(wěn)定、鑒別能力強(qiáng)，是開展梅毒流行病學(xué)調(diào)查的有力工具。
　　耐藥是導(dǎo)致梅毒患者臨床治療失敗的主要因素。近年來國內(nèi)外報(bào)道的耐紅霉素、阿奇霉素的Tp菌株逐年增加，因此開展本地區(qū)Tp對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性監(jiān)測具有重要的臨床意義。與阿奇霉素不同，目前還未見有Tp耐多西環(huán)素的報(bào)道，但作為疾病預(yù)防控制中心（CDC）推薦的治療梅毒二線用

3、藥，已明確提出有必要對(duì)Tp多西環(huán)素耐藥性進(jìn)行監(jiān)控。
　　在《中國預(yù)防與控制梅毒規(guī)劃（2010-2020年）》白皮書中，我國梅毒控制主要措施就包括提高梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測質(zhì)量及加強(qiáng)梅毒篩查力度。目前，血清學(xué)試驗(yàn)作為梅毒診斷的主要依據(jù)，但均存在局限性。PCR作為一種有力的診斷手段，近十多年來，基于PCR的梅毒檢測方法報(bào)道較多，該方法在檢測梅毒下疳分泌物時(shí)，有較好的敏感性和特異性，而當(dāng)檢測血液及其他標(biāo)本時(shí)，盡管有很好的特異性，但因敏感性較低，

4、從而限制了該方法在臨床上的應(yīng)用，因而建立一種敏感性及特異性高的梅毒核酸檢測方法十分必要。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）是近年來一種新型核酸檢測技術(shù)，具有簡單、高效快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可多種方式判定結(jié)果，并且能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，在疾病診斷和流行病學(xué)調(diào)查方面具有非常廣闊的前景。
　　目的：本研究對(duì)湖南幾個(gè)主要城市的Tp流行株進(jìn)行分子分型并對(duì)23S rRNA和16S rRNA上耐藥位點(diǎn)進(jìn)行檢測，揭示湖南地區(qū)的Tp流行型別及大環(huán)內(nèi)酯類抗

5、生素和多西環(huán)素的耐藥現(xiàn)狀，為本地區(qū)梅毒的監(jiān)控和防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。建立Tp DNA的LAMP檢測方法，并初步探索該方法在二期梅毒診斷中的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：收集湖南部分城市（衡陽、長沙、岳陽、常德、郴州、永州）二期及潛伏梅毒患者2,253份全血樣本，分別以polA、tpp47、bmp和tp0319為靶基因?qū)γ范净颊呷獦颖具M(jìn)行PCR篩選，任一靶基因陽性樣本被認(rèn)定為含有Tp DNA，將作為下一步研究樣本。
　　以arp、tpr

6、和tp0548作為分型靶基因分別對(duì)篩選出的陽性樣本進(jìn)行擴(kuò)增，確定arp基因重復(fù)序列數(shù)目；分析tpr基因RFLP型別；比對(duì)tp0548基因序列，確定型別。結(jié)合三個(gè)基因的型別確定全血樣本中Tp DNA亞型。
　　采用nPCR擴(kuò)增篩選陽性標(biāo)本中Tp23S rRNA，23S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物純化后分別用限制性內(nèi)切酶 MboⅡ和BsaⅠ酶切，凝膠電泳觀察結(jié)果；純化產(chǎn)物測序比對(duì)。
　　采用nPCR擴(kuò)增篩選陽性標(biāo)本Tp16S rRNA，陽

7、性產(chǎn)物純化后測序，測序結(jié)果與Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株比對(duì)。
　　選取bmp作為靶基因，建立Tp-LAMP方法，擴(kuò)增一系列10倍稀釋的Tp Nichols株DNA，評(píng)價(jià)其靈敏度；以鉤端螺旋體、伯氏螺旋體及常見臨床菌株為對(duì)照，評(píng)價(jià)其特異性；檢測二期梅毒患者及健康獻(xiàn)血者全血樣本，初步評(píng)價(jià)LAMP的臨床應(yīng)用。
　　結(jié)果：常規(guī)PCR篩選2,253例梅毒全血標(biāo)本，靶基因polA、tpp47、bmp和tp0319的陽性率分別為18.8%

8、（423/2,253）、18.4%（415/2,253）、17.5%（395/2,253）和14.2%(321/2,253)，共篩選出455例Tp DNA陽性標(biāo)本。
　　采用降落PCR從455例PCR陽性樣本中擴(kuò)增出203例arp基因，得到8種型別，其中以14個(gè)重復(fù)序列最為常見（62.6%，127/203）；采用nPCR擴(kuò)增tpr基因，獲得385例陽性產(chǎn)物，經(jīng)MseI酶切后，RFLP分析tpr基因得到8種型別，其中以d型為主（62

9、.1%，239/385）；采用nPCR擴(kuò)增tp0548基因，擴(kuò)增出381例，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后與公布的參考序列進(jìn)行比對(duì)，得到4個(gè)型別，分別為f、a、c和g型。組合arp/tpr/tp0548均陽性的樣本，188例樣本能完全分型，可分為32個(gè)亞型，其中以14d/f亞型為主，占36.5%，其余的主要亞型分別為14a/f、14e/f、12e/f、12d/f、6d/f、11d/f、14j/f、8d/f、14d/a、14p/f、14d/c、14l

10、/f、14e/a、14a/c、12d/a、5d/f、14b/f、6d/a、11o/f、12e/a、14d/g、14e/c、14a/a和14b/f。
　　nPCR分別擴(kuò)增23S rRNA和16S rRNA基因，455例PCR篩選陽性標(biāo)本中分別擴(kuò)增出400例23S rRNA基因，438例16S rRNA基因。經(jīng)酶切和測序分析23S rRNA基因，有390例樣本發(fā)生A2058G突變，其中二期梅毒占260例，潛伏梅毒占130例；未發(fā)現(xiàn)A2

11、059G突變。16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序分析后，尚未發(fā)現(xiàn)G1058C突變。
　　建立Tp-bmp-LAMP方法，檢測一系列10倍稀釋的Tp Nichols DNA模板，靈敏度達(dá)4.3×100拷貝數(shù)/μL數(shù)量級(jí)，而傳統(tǒng)bmp-PCR法檢測限為4.3×102拷貝數(shù)/μL；檢測對(duì)照菌株和健康者血液時(shí)Tp-bmp-LAMP法和常規(guī)bmp-PCR法均為陰性；在檢測603例二期梅毒患者血液標(biāo)本時(shí)，Tp-bmp-LAMP檢出503例，敏感性

12、、特異性分別為83.4%和100%。
　　結(jié)論：
　　1)polA，tpp47和bmp可作為核酸檢測（NAT）的候選靶基因。
　　2)2013～2015年湖南地區(qū)Tp流行株有32個(gè)基因亞型，其中以14d/f為主要流行型別。
　　3)在湖南地區(qū)梅毒螺旋體流行株存在高頻率23S rRNA基因A2058C點(diǎn)突變，臨床上在治療梅毒時(shí)，需謹(jǐn)慎使用大患內(nèi)酯類抗生素。
　　4)在湖南地區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)Tp16S rRNA基因G