螺旋體的基因調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、螺旋菌會導(dǎo)致多種嚴(yán)重的疾病，如萊姆病，梅毒等。螺旋菌的致病機(jī)制復(fù)雜，很難研究。蒼白密螺旋體，又稱梅毒螺旋體（Treponema pallidum），是梅毒的病原體。由于其不能在體外培養(yǎng)，很難進(jìn)行體外的研究，所以致病機(jī)制至今不清。而伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi），是萊姆病的病原體，由于其可以在體外培養(yǎng)，所以致病因子調(diào)節(jié)通路已經(jīng)被廣泛研究。本研究首先針對伯氏疏螺旋體rrp2基因的功能進(jìn)行研究。在伯氏疏螺旋體的流動周

2、期中，RpoN-RpoS通路對許多不同基因的表達(dá)起了至關(guān)重要的作用。RpoN-RpoS通路能夠被應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白(response regulator)/sigma-54依賴的刺激子（也稱作細(xì)菌增強(qiáng)子結(jié)合蛋白，bEBP）Rrp2激活。Rrp2除了激活RpoN-RpoS信號通路之外，還有另外一種功能:控制伯氏疏螺旋體的生長。但是細(xì)菌的生長并不需要RpoN-RpoS通路的存在。Rrp2是怎樣控制細(xì)菌生長的？這一機(jī)制仍然需要探索。本研究中，通過構(gòu)

3、建一系列基因組rrp2部分敲除的條件敲除菌證明，Rrp2-N端對細(xì)菌的生長至關(guān)重要;接著發(fā)現(xiàn)，Rrp2氮端的D52磷酸化位點(diǎn)敲除導(dǎo)致伯氏疏螺旋體死亡，證明磷酸化位點(diǎn)與伯氏疏螺旋體的生存相關(guān)。Rrp2中央?yún)^(qū)域ATPase功能域（Rrp2-G239C）的突變株并沒有生長缺陷，暗示著伯氏疏螺旋體的生長并不是被Rrp2的磷酸化控制的sigma-54的激活作用而影響。我們進(jìn)一步地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲除碳端或者h(yuǎn)elix-turn-helix（HTH， DN

4、A結(jié)合功能域）功能域的最后16個氨基酸時，螺旋體不能生長，證明有磷酸化控制的DNA結(jié)合作用與伯氏疏螺旋體的生存相關(guān)。由于過表達(dá)rpoS會導(dǎo)致伯氏疏螺旋體的死亡，接下來就證明了Rrp2敲除株的死亡并不是由于rpoS過表達(dá)的原因。這一部分的數(shù)據(jù)證明，Rrp2的磷酸化控制的寡聚化和DNA結(jié)合功能，很可能發(fā)揮著抑制子的作用，在伯氏疏螺旋體的生長復(fù)制中發(fā)揮著非常重要的作用。此外，還發(fā)現(xiàn)，除了以上兩種作用，Rrp2還有第三種作用:在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)另

5、一轉(zhuǎn)錄因子，BosR。在伯氏疏螺旋體菌株中過表達(dá)Rrp2，發(fā)現(xiàn)BosR的水平明顯升高。定量PCR的結(jié)果證明，Rrp2是在轉(zhuǎn)錄的水平上調(diào)節(jié)BosR。
　　為了克服梅毒螺旋體不可以在體外培養(yǎng)這一缺點(diǎn)，利用體外可培養(yǎng)的伯氏疏螺旋體作為載體菌，將梅毒螺旋體的基因轉(zhuǎn)入相應(yīng)的伯氏疏螺旋體菌株進(jìn)行功能性表達(dá)，進(jìn)而對梅毒螺旋體的基因功能進(jìn)行研究。本研究中，構(gòu)建一個攜帶梅毒螺旋體基因tp0111的大腸桿菌-伯氏疏螺旋體穿梭質(zhì)粒，利用電轉(zhuǎn)化法，將質(zhì)粒

6、轉(zhuǎn)入相應(yīng)的伯氏疏螺旋體菌株中，通過觀察伯氏疏螺旋體的表型和相關(guān)基因表達(dá)變化，來研究梅毒螺旋體的基因功能。結(jié)果，成功地將梅毒螺旋體基因tp0111轉(zhuǎn)入伯氏疏螺旋體rpoN突變株內(nèi)之后發(fā)現(xiàn)，tp0111轉(zhuǎn)入株一定程度上回補(bǔ)了伯氏疏螺旋體突變株的表型缺陷，外膜蛋白OspC的表達(dá)量有明顯的恢復(fù)。結(jié)果證明，伯氏疏螺旋體可以作為載體來研究梅毒螺旋體的致病因子及其基因調(diào)控系統(tǒng)。由此我們可以推測梅毒螺旋體的致病因子，利用這一載體菌進(jìn)行新的研究，從而最終