中國萊姆病螺旋體MLVA分型方法的建立與研究.pdf

1、目的：
　　建立適合中國萊姆病螺旋體（又稱伯氏疏螺旋體）的多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析（multi-locusvariablenumbertandemrepeatanalysis,MLVA）基因分型方法，對來自中國12個省45個地區(qū)的95株伯氏疏螺旋體進行MLVA分型鑒定和聚類分析，探討中國伯氏疏螺旋體菌群特征，并為萊姆病的分子流行病學調查，疫情溯源及菌群進化分析提供實驗基礎和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.MLVA

2、是一種以可變數(shù)目串聯(lián)重復序列（variablenumbertandemrepeat,VNTR）為基本單位的，根據(jù)每個位點VNTR在不同菌株中的多態(tài)性即拷貝數(shù)的差異，形成VNTR分辨率，通過VNTR分辨率的可疊加性以獲得對菌株的最佳分辨效果的基因分型方法。
　　2.使用TandemRepeatsFinder基因掃描軟件掃描中國優(yōu)勢菌種Borreliagarinii的國際參考菌株PBi的904.246kb染色體基因和質粒（CP26和L

3、P54）基因，分析基因結構特點，篩選多個潛在的VNTR位點。
　　3.利用PCR（PolymeraseChainReaction）技術檢驗潛在VNTR位點的普遍擴增性和特異性差異的分辨能力。
　　4.通過STR（ShortTandemRepeat）測序收集VNTR信息并建立菌株VNTR譜。
　　5.聚類分析，用BioNumerics5.1軟件處理數(shù)據(jù),用Categorical系數(shù)和UPGMA（UnweightedPai

4、r-GroupMethodwithArithmetic，非加權算術平均法）進行聚類分析，初步建立萊姆病螺旋體的MLVA分型方法，進而對95株中國菌株和6株國際參考株進行MLVA分型研究，并與多位點序列分析（multi-locussequenceanalysis,MLSA）的基因分型結果進行比較。
　　結果：
　　1.篩選出5個VNTR位點進行組合，建立萊姆病螺旋體的MLVA方法。將101株萊姆病螺旋體分為51個獨立的基因型，

5、4個明顯的基因簇，即Borreliaburgdorferisensustricto,Borreliagarinii,Borreliaafzelii,Borreliavalaisiana。分型結果與MLSA基因分型結果一致。
　　2.全部5個VNTR位點（VNTR-1,VNTR-2,VNTR-3,VNTR-4,和VNTR-5）對應的等位基因種類數(shù)分別為7,3,9,7和6；相應的位點多態(tài)性指數(shù)為0.79,0.22,0.77,0.71和

6、0.67；5個VNTR位點分辨率疊加，多態(tài)性指數(shù)達0.96。
　　結論：
　　1.建立了一種適合中國萊姆病螺旋體菌株的MLVA基因分型的方法。MLVA分型方法操作簡單，分型穩(wěn)定，重復性好，分型結果準確可靠。
　　2.聚類分型結果表明中國萊姆病螺旋體表現(xiàn)出廣泛的遺傳異質性，存在Borreliaburgdorferisensustricto,Borreliagarinii,Borreliaafzelii,Borreliav