水稻白葉枯菌MLVA基因分型方法的建立.pdf

1、水稻白葉枯病(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，簡稱Xoo)是水稻種植區(qū)的世界性病害，尤其以亞洲稻區(qū)發(fā)生最重，是我國為水稻的三大病害之一。研究病原菌群體遺傳結構將有助于籌劃育種策略以及合理的安排抗性品種的種植布局，從而使該病害的發(fā)生控制在適度的水平。應用分子標記技術可以較好的從基因水平揭示種群間個體的差異，這方面的研究報道很多。目前，用于對Xoo基因分型的分子標記技術主要有限制性片段長度多態(tài)性(Restricti

2、on Fragment LengthPolymorphism，RFLP)、隨機擴增多態(tài)性(Random Amplified Ploymorphic DNA,RAPD)、插入序列PCR法(IS-PCR)、重復序列PCR法(Rep-PCR)等，但這些方法均存在一些不足，如分辨率低、重復性差、技術要求高等。近年來隨著許多物種的全基因組序列測序工作的完成，以此為基礎的多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析(Multiple-Locus Variable

3、-numbertandem-repeat Analysis，MLVA)逐漸被廣泛應用于各物種的基因分型研究中。本研究應用MLVA基因分型方法取得的主要結果如下：
　　 1.本研究采用Tandem Repeats Finder software(TRF)軟件在2-7-7-50策略下對三株測序菌株PXO99A、KACC10331、MAFF311018的全基因組序列進行分析，分別得到了421、389、393個可變串聯(lián)重復序列位點(Va

4、riable Number of TandemRepeat，VNTR)。通過人工篩選比對這些位點，發(fā)現(xiàn)了只有重復單元TR1在該三株菌株中的重復數(shù)分別為9.6、20.6、13.6，表現(xiàn)出了重復次數(shù)的多態(tài)性。對人工篩選出的VNTR位點設計引物，通過現(xiàn)實模板菌株的PCR擴增、PCR擴增產物測序分析，最終確立7個VNTR位點用以構建水稻白葉枯菌的MLVA基因分型體系。
　　 2.應用構建的該MLVA基因分型體系對湖北7地區(qū)的158株白葉

5、枯菌進行MLVA分型實驗，結果顯示，TR1位點的多態(tài)性較好(h＞0.58)，其他6個位點多態(tài)性呈中等程度(0.10≤h≤0.58)。MLVA分型體系將湖北7地區(qū)的158株白葉枯菌株分為31個基因型，在70％相似水平上，可分為10簇，其中A簇共96株，占菌株總數(shù)的60.76%，說明該簇為湖北稻區(qū)白葉枯菌的主要簇群，其他各簇所占菌株總數(shù)比例較低。各地區(qū)菌株在簇群的分布上，宜昌地區(qū)的菌株構成最為復雜，在8個簇群均有分布，而某些地區(qū)的菌株有一定

6、的地理特屬性，如F簇只有來自宜昌的兩個菌株YC5、YC6。用MLVA分型結果和rep-PCR的ERIC引物分型結果進行比較，ERIC引物可將湖北稻區(qū)的白葉枯菌株分為26種譜型，表明MLVA分型在分辨能力上優(yōu)于ERIC引物，而在成簇表現(xiàn)上，ERIC引物在70%相似水平上可成11簇，且有兩個主力簇群，成簇上ERIC更佳。
　　 綜上所述，本研究構建的MLVA基因分型體系具有較好的分型能力，尋求更多具有多態(tài)性的VNTR的位點，以優(yōu)化V