家蠶CPAP3蛋白的重組表達(dá)與純化及性質(zhì)研究.pdf

1、表皮對于昆蟲是極其重要的結(jié)構(gòu)，它能幫助抵御化學(xué)侵蝕，物理損傷及病原微生物感染。表皮主要是由幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，其中包裹著幾丁質(zhì)的蛋白具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性。家蠶蛻皮液的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了六個(gè)獨(dú)特的蛋白，它們都包含三個(gè)14家族的幾丁質(zhì)結(jié)合模塊，因此被稱為CPAP3(cuticleproteinanaloguetoperitrophinwith3chitinbindingdomains)，它們被推測是從被降解的舊表皮釋放到蛻皮液中的。目前在赤

2、擬谷盜中，CPAP3蛋白已經(jīng)被證明在維持表皮結(jié)構(gòu)的完整性中發(fā)揮重要作用。因此，針對家蠶CPAP3s蛋白與幾丁質(zhì)結(jié)合性質(zhì)的研究，有助于在蛋白層面上理解CPAP3s在幾丁質(zhì)形成及表皮裝配過程中如何發(fā)揮功能。
　　本論文的研究工作包括:
　　(1)利用PCR技術(shù)調(diào)取家蠶的六個(gè)CPAP3s基因（BmCPAP3-A1，BmCPAP3-A2，BmCPAP3-B，BmCPAP3-C，BmCPAP3-D1和BmCPAP3-D2），它們的開放

3、閱讀框大小依次為714bp，684bp，873bp，789bp，645bp和621bp。氨基酸序列的N-端普遍存在信號(hào)肽，推測為分泌蛋白。BmCPAP3s的基因轉(zhuǎn)錄水平研究表明，在不同發(fā)育過程中，BmCPAP3-A1，BmCPAP3-A2，BmCPAP3-B和BmCPAP3-C在化蛹時(shí)表達(dá)量最高，而BmCPAP3-D1和BmCPAP3-D2分別在成蟲前24h和化蛹后12h表達(dá)量最高。這些現(xiàn)象暗示了BmCPAP3基因可能在昆蟲蛻皮過程中發(fā)

4、揮作用。
　　(2)構(gòu)建BmCPAP3s的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株中，再用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。結(jié)果在菌體破碎液的上清中檢測到重組蛋白，利用金屬螯合層析分離純化得到目的蛋白。每升發(fā)酵液的蛋白產(chǎn)量分別為:BmCPAP3-A1，5.0mg;BmCPAP3-A2，7.5mg;BmCPAP3-B,1.2mg;BmCPAP3-C,5.5mg;BmCPAP3-D1,1.0mg;BmCPAP3-D2,1.3mg。
　　(3)

5、對重組BmCPAP3s進(jìn)行幾丁質(zhì)結(jié)合活性的研究。研究了它們對固體幾丁質(zhì)，膠體幾丁質(zhì)和部分去乙?；瘞锥≠|(zhì)（殼聚糖）的結(jié)合活性。結(jié)果證明六個(gè)BmCPAP3s蛋白都能與以上三種底物結(jié)合。但是，它們對固體幾丁質(zhì)表現(xiàn)出非常強(qiáng)的結(jié)合活性（結(jié)合量超過80％），對膠體幾丁質(zhì)結(jié)合能力稍弱（結(jié)合量約40％），對殼聚糖的結(jié)合能力最弱（絕大多數(shù)蛋白結(jié)合量低于30％），暗示了它們更傾向結(jié)合乙?；木B(tài)幾丁質(zhì)。
　　(4)通過HPLC分析了BmCPAP3-C