擬南芥EFR與黑腹果蠅SCOT蛋白重組表達、純化及晶體研究.pdf

1、獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其霰人已繹發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得墓舜象匆蹲或其他教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文作者簽名：紛癡眷目簽字日期：如侈年‘月7日學位論文版權使用授權書本學位論文作者完全了解關保留、使用學位論文的規(guī)定

2、，有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和傳閱。本人授磁時以將學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存j匯編學位論文。(保密的學位論文在解密后適用本授權書)學位論文作者簽名：絳岬導師簽名：妒出簽字日期：仂l多年6月7日簽字日期：叫多年6月歹7日學位論文作者畢業(yè)去向：工作單位：電話：通訊地址：郵編：的NBLRR蛋白識別外源病原微生物效應因子激活并下游免疫應答反應的

3、途徑仍然不清晰。因此我們分別依次構建了擬南芥EFR(6751031)His—TEVpET28a／EFR(681—1019)一His—TEVpET28a／EFR(695—1002)一His—TEVpET28a重組表達質粒。試表達檢測表明除了EFR(6951002)一His—TEVpET28a蛋白不表達，其它兩個亞克隆都能表達蛋白。通過NiNTA親和層析柱進行純化，發(fā)現(xiàn)EFR(6751031)一His—TEVpET28a／EFR(681—1

4、019)His—TEVpET28a表達出的目的蛋白可溶。EFR(675—1031)一His—TEVpET28a和EFR(69l一1019)一His—TEVpET28a表達出的目的蛋白經NiNTA親和層析和superdex200凝膠過濾層析后，得到高純度的穩(wěn)定均一蛋白用于蛋白晶體生長。通過坐滴氣象擴散法，采用HamptonResearchCrystalScreenI、CrystalScreenII、SaltRxTMl、SaltRxTM2、

5、PEGRxTMl、PEGRxTM2、EmeraldBiosystemsWizardI、WizardII、IndexI和IndexII蛋白晶體生長試劑盒進行蛋白晶體篩選。琥珀酰輔酶A轉移酶(SCOT)催化琥珀酰輔酶A和乙酰乙酸生成乙酰乙酰輔酶A和琥珀酸。乙酰乙酰輔酶A在線粒體中硫解酶的作用下產生成兩分子乙酰輔酶A，乙酰輔酶A進入檸檬酸循環(huán)。琥珀酰一CoA轉移酶(SCOT)催化琥珀酰上的CoA基團轉移到乙酰乙酸上。乙酰乙酸酯是酮體的化合物之

6、一。酮體由肝臟產生的，并通過血流轉運至肝外組織，如心臟和大腦，被用作為生物體新陳代謝的一種能量。在這些肝外組織的線粒體中，SCOT蛋白催化反應生成乙酰乙酰CoA，乙酰乙酰CoA經硫解酶轉化生成乙酰輔酶A。然后乙酰輔酶A再進入三羧酸循環(huán)為生物體新陳代謝提供能源。生物體內SCOT蛋白缺失會引起酮酸中毒。SCOT蛋白結合CoA后形成一個中間過渡態(tài)產物來催化反應的進行。通過WilliamJencks對豬心臟SCOT蛋白的實驗研究發(fā)現(xiàn)，琥珀酰輔酶

7、A上的CoA基團與SCOT蛋白上305位點上的谷氨酸殘基結合，形成一個酸酐的中間體。然而，目前對于黑腹果蠅中的CoA轉移酶的相關研究很少。所以，我們構建了黑腹果蠅中的CoA轉移酶原核表達質粒ScotHis—TEVpET28a，重組質粒經IPTG誘導表達出目的蛋白，目的蛋白通過NiNTA親和層析以及superdex200凝膠過濾層析等蛋白純化方法獲得了純度超過95％且均一性較好的目的蛋白。通過坐滴氣象擴散法，采用HamptonResear