家蠶膜蛋白觸角結(jié)合蛋白(ABP)的純化及功能研究.pdf

1、靈敏的嗅覺(jué)對(duì)于昆蟲(chóng)正常的成長(zhǎng)發(fā)育、繁衍后代具有重要的作用，昆蟲(chóng)的嗅覺(jué)系統(tǒng)是一個(gè)非常靈敏和專一性很強(qiáng)的化學(xué)監(jiān)測(cè)器，能從環(huán)境中成千上萬(wàn)種不同氣味中識(shí)別出濃度低達(dá)幾百萬(wàn)分之一的某些特殊氣味物質(zhì)。昆蟲(chóng)能感受得到的環(huán)境中的氣味物質(zhì)絕大多數(shù)是脂溶性的小分子化合物，這些小分子化合物能夠通過(guò)觸角上皮細(xì)胞間的微小的孔道擴(kuò)散到觸角感受器淋巴液，但是觸角感器的淋巴液是親水性的液體，外界環(huán)境中親脂性的氣味分子不能直接穿過(guò)這些親水性的淋巴液而到達(dá)嗅覺(jué)神經(jīng)樹(shù)突末梢

2、，這就需要?dú)馕督Y(jié)合蛋白(odorantbindingproteins，OBPs)的幫助。
　　 觸角結(jié)合蛋白(antennalbindingprotein，ABP)是氣味結(jié)合蛋白的一個(gè)亞類，推測(cè)其在昆蟲(chóng)嗅覺(jué)中起作用，但目前還沒(méi)有關(guān)于ABP三維結(jié)構(gòu)及其功能的詳細(xì)報(bào)道。本論文通過(guò)對(duì)ABP同源蛋白的分析、ABP的生物信息學(xué)及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，推測(cè)ABP是鑲嵌在細(xì)胞內(nèi)膜的外周膜蛋白。ABP蛋白鑲嵌在細(xì)胞內(nèi)膜表面，當(dāng)與氣味分子結(jié)合后通過(guò)構(gòu)

3、象改變脫離膜表面，溶解并攜帶氣味分子穿過(guò)親水性液體，運(yùn)送到特定部位，同源蛋白分析及三級(jí)結(jié)構(gòu)及預(yù)測(cè)也顯示ABP結(jié)構(gòu)中含有親水與疏水性結(jié)構(gòu)，鑒于ABP的膜蛋白結(jié)構(gòu)特性，本論文通過(guò)添加去垢劑CHAPS分離純化天然膜蛋白觸角結(jié)合蛋白，又利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)純化融合表達(dá)的ABP蛋白，從這兩個(gè)方面研究對(duì)ABP進(jìn)行探索試驗(yàn)，為后續(xù)研究其結(jié)構(gòu)和功能提供了一個(gè)新的方法和工具。
　　 本文天然純化實(shí)驗(yàn)材料是家蠶蠶蛹粉:原材料處理方法包括勻漿、差

4、速離心、密度梯度離心，然后利用高壓破碎和超速離心等方法手段獲得最初的膜組分，再經(jīng)離子交換層析進(jìn)一步純化膜組份。使用兩性離子去垢劑CHAPS，所用儀器主要是AKTAexplorerl0蛋白純化儀，分離純化步驟包括陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定;初步獲得的蛋白樣品再經(jīng)過(guò)雙向電泳及質(zhì)譜分析鑒定，經(jīng)過(guò)肽段指紋圖譜分析，最終純化到天然的觸角結(jié)合蛋白。
　　 通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測(cè)得知，家蠶觸角結(jié)

5、合蛋白ORF含有423bp，編碼一個(gè)140個(gè)氨基酸殘基的單鏈多肽，蛋白相對(duì)分子量為15.5kDa，等電點(diǎn)為6.71，有一段由21個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽和6段.螺旋，每個(gè).螺旋上有一個(gè)半胱氨酸殘基并相互交叉形成3個(gè)二硫鍵，使得觸角結(jié)合蛋白形成一個(gè)口袋裝的三維結(jié)構(gòu)。通過(guò)家蠶蠶蛹提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板克隆ABP基因，設(shè)計(jì)引物時(shí)切去了信號(hào)肽部分的堿基構(gòu)建pET-32a-ABP（無(wú)SP）重組載體，成功誘導(dǎo)并大量表達(dá)融合目的蛋