家蠶HMGA蛋白的原核表達(dá)與功能研究.pdf

1、浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文家蠶HMGA蛋白的原核表達(dá)與功能研究姓名：趙燕申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：童富淡;張耀洲20091201浙江理工大學(xué)碩十學(xué)位論文A b s t r a c tH M G A f f I i g hM o b i l i t yC _ r r o u p A ) p r o t e i n sa r e a k i n do fn o n h i s t o n ep r o t e i

2、n ss i t u a t e di nt h ec h r o m o s o m e ．A l lo fH M G A p r o t e i n sh a v en i n ec o n s e r v a t i v ea m i n oa c i ds e q u e n c ea n da Ct e r m i n a l 晰也n e g a t i v ec h a r g e ，t h ef o r m e r b i

3、 n d w i t ht h em i n o rg r o o v e o fD N A s e q u e n c er i c h e di nA T , c a l l e dA T - h o o kd o m a i n ．N o w , t h e r ea r em a n y r e s e a r c h e sa b o u tH M G A , b u t t h eo n l yr e s e a r c h

4、a b o u tH M G A i ns i l k w o r m w a s 也ef u n c t i o no f t h eH M G A a b o u t o v i c e l lm a t u r a t i o n ．A g e n es e q u e n c e n a m e d H M G A w a s s c r e e n e d f r o m N C B I G e n b a n k ．B yb

5、 l a s t c o n t r a s t i n gw i 也B o m b y xm o r ig e n o m e ，i tW a sc e r t e i n e d g e n eo fB o m b y xm o r i ．S ow en a m e dt h i sg e n e 弱B m H M G A ( B o m b y x m o r iH M G A ) ．T h e t h e a c c e s s

6、 i o nn u m b e r W a SD Q 4 0 2 5 1 2 ．T h eB m H M G A g e n ec o n t a i n e do n l yo n e e x o n ．T h el e n g t ho f t h ec D N A i s 1 2 0 5 b p ，i tc o n t a i n sa l lO R F o f 3 4 5b p ，e n c o d i n g 1 14 a n

7、 l i n oa c i d s 、加戧lt h e p r e d i c t e dm o l e c u l a rw e i g h to f12 ．2 4 k Da n di s o e l e c t r i cp o i n t o f 9 ．5 8 ．T w o p r i m e r s w e r e d e s i g n e d t oa m p l i f y t h ec o d i n g r e g i

8、 o no f B m H M G A g e n e 、析也t e m p l a t eo fc D N A o f p u p a ．1 1 1 eO R F o f t h i sg e n ew a s c l o n e d i n t op E T - 2 8 a ( + ) v e c t o r w i t h B a m H Ia n d X h oI d i g e s t i o n ．T h er e c o

9、m b i n a n tp l a s m i dW a s t r a n s f o r m e di n t o E ．c o l iB L 2 1 ( D E 3 ) s t a r ．P C Ra n dd i g e s t i o nw i t hB a m H I ／X h o I s h o w e dt h a t t h ed e s i g n e d f r a g m e n t w a s i n s e

10、 r t e dc o r r e c t l y ．T h er e c o m b i n a n tp l a s m i dW a ss e q u e n c e da n dt h e r e s u l ti n d i c a t e dt h a tar e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i dW a sc o n s t r u c t e d s u c

11、 c e s s f u l l y ．R e c o m b i n a n tp r o t e i n W a se x p r e s s e d s u c c e s s f u l l y i nE ．c o l iB L 2 1 ( D E 3 ) s t a r a f t e ri n d u c e db yI P T Gw i m t h ef i n a l c o n c e n t r a t i o no

12、 fl m m o l ／L ．T h ea n a l y s i so f S D S - P A G Es h o w e d t h a tt h ef u s i o n p r o t e i nH i s —B m H M G A W a s e x p r e s s e d h i g h l yi nB L 2 1w i t ha m o l e c u l a r w e i g h to f 2 2k D ，t

13、h e nc h a r a c t e r i z e d b ym a s s - s p e c t r u m ，t h er e s u l t p r o v e d t h a tH i s - t a gB m H M G A W a S e x p r e s s e d i n t h ef i g h tf o r m 。M o s t o f r e c o m b i n a n t p r o t e i n

14、W a s s o l u b l ea n dW a sp u r i f i e dw i t hm e t a l —c h e l a t i n g 稠丘n 時c h r o m a t o g r a p H y ．P o l y c l o n a la n t i b o d yw e r eg e n e r a t e db yi m m o l u n i n ga N e w Z e a l a n dr a b

15、 b i tw i t hr e c o m b i n a n tp r o t e i na n dt h et i t e ro fi t w a so v e r 1 ：1 28 0 0 ，m e a s u r i n gb yE L I S A ．T h et o t a lR N A w e r ee x t r a c t e df r o ms i l k w o r mf o u rd i f f e r e n t

16、s t a g e sa n d t h e f i f t hi n s t a rl a r v a t i s s u e s ．T h et r a n s c r i p t i o nl e v e lo f B m H M G A W a s a n a l y z e d b y R T —P C R ，1 1 1 er e s u l Bs h o w e d t h a tt h eB m H M G A g e n

17、 et r a n s c r i p t sw a sh i g h e ri ne g gc o m p a r e d t oo t h e rs t a g e s ，a n dh i g h e r i nb r a i nc o m p a r e d t oo t h e r t i s s u e si nf i f t hi n s t a rl a r v a T h e nn l e t o t a lp r o