真核與原核表達(dá)鈣網(wǎng)蛋白免疫活性之比較研究.pdf

1、鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin，CRT）是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的保守蛋白，具有三個(gè)結(jié)構(gòu)域N-domain，P-domain和C-domain。其中N-domain為凝集素結(jié)合序列，輔助新合成蛋白的正確折疊；P-domain和C-domain具有超強(qiáng)的結(jié)合Ca2+能力，可以維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，參與Ca2+介導(dǎo)的信號(hào)通路。
　　隨著CRT研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)CRT可定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外。許多細(xì)胞表面都可以檢測(cè)到CRT的表達(dá)，CRT通過(guò)與L

2、DL受體相關(guān)蛋白（LRP）結(jié)合錨定在細(xì)胞表面，發(fā)揮其免疫相關(guān)的生物學(xué)功能。此外，CRT還可被分泌至細(xì)胞外，成為可溶性(soluble CRT,sCRT)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)23.3%的RA和21.9%的SLE病人血清中可檢測(cè)到sCRT，而健康人血清中sCRT均在檢測(cè)限以下，這一結(jié)論也得到其他課題組的驗(yàn)證。自身免疫病患者血清中檢測(cè)到CRT特異性抗體的報(bào)道也頗為常見，提示sCRT可能具有免疫原性。原核重組表達(dá)的CRT片段rCRT/39-2

3、72具有超強(qiáng)的免疫刺激活性，表現(xiàn)為在低劑量下可刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α、IL-6，并具有超強(qiáng)的免疫佐劑效應(yīng)等。由此推論，血清sCRT濃度與RA等自身免疫性疾病密切相關(guān)，而且可能是一個(gè)提示自身免疫病病情嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。
　　真核表達(dá)體系比原核表達(dá)體系有更為完善的蛋白折疊及翻譯后修飾，可以更好地呈現(xiàn)天然蛋白的功能。本課題通過(guò)構(gòu)建CRT的真核表達(dá)載體，并表達(dá)純化得到真核重組CRT（eukaryocyte CRT，e

4、CRT），并將其與原核重組CRT（recombinant CRT，rCRT）對(duì)比發(fā)現(xiàn)rCRT主要以多聚體形式存在，eCRT僅以單體形式存在。與rCRT的超強(qiáng)免疫刺激活性相比，eCRT的激活作用則大為遜色。進(jìn)一步分析理化性質(zhì)與CRT功能的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)脫糖基化的eCRT（tun-eCRT）與eCRT相比，刺激活性增強(qiáng)十倍左右，并且多聚體形式的原核重組rCRT（OrCRT）發(fā)揮主要的免疫刺激活性，而單體形式的原核重組rCRT（MrCRT）的免疫

5、刺激活性與eCRT相仿。
　　對(duì)rCRT激活巨噬細(xì)胞的機(jī)理進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)rCRT刺激巨噬細(xì)胞可促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)rCRT的內(nèi)吞并定位于溶酶體，受體阻斷實(shí)驗(yàn)證明內(nèi)吞作用依賴于清道夫受體A。基因水平研究發(fā)現(xiàn)MrCRT及OrCRT均可促進(jìn)TNF-α及IL-6 mRNA的轉(zhuǎn)錄，但不影響mRNA的穩(wěn)定性。TNF-α以及IL-6共同轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的抑制劑可完全抑制CRT刺激的TNF-α及IL-6的轉(zhuǎn)錄，并且低劑量的OrCRT可有效促進(jìn)IkBa

6、的降解及NF-kB的磷酸化，MrCRT的刺激作用相之較弱。OrCRT可持續(xù)激活MAPK家族三個(gè)激酶的磷酸化，但抑制劑阻斷實(shí)驗(yàn)證明CRT刺激巨噬細(xì)胞釋放TNF-α依賴于JNK的激活，釋放IL-6是JNK、ERK共同介導(dǎo)的。此外，OrCRT和MrCRT均可抑制Ca2+-ATP酶的活性，使胞內(nèi)鈣離子濃度升高，從而誘導(dǎo)UPR的效應(yīng)分子GRP78/Bip水平升高，啟動(dòng)下游信號(hào)通路的激活，進(jìn)而激活JNK以及NF-kB，增強(qiáng)靶基因TNF-α、IL-6