苦瓜蛋白MAP30的原核表達(dá)及活性研究.pdf

1、苦瓜，在明代《滇南本草》中第一次被記錄入藥，作為一種古老的藥食同源植物，傳統(tǒng)中藥功效為除邪熱，解勞乏，清心明目。隨著現(xiàn)代提取分離技術(shù)的發(fā)展，如今已經(jīng)從苦瓜中提取得到了多種具有藥理活性的物質(zhì)，包括皂苷、多糖、蛋白及萜類化合物。其中，從苦瓜中分離得到的核糖體失活蛋白MAP30（Momordica anti-HIV protein of30 KD）具有廣譜的抑菌性、抗病毒和抗腫瘤活性，其對未感染的靶細(xì)胞及其他正常細(xì)胞也表現(xiàn)出極小細(xì)胞毒性或細(xì)胞

2、抑制效應(yīng)，因而成為本次研究的具體對象。利用傳統(tǒng)提取分離方法去提取MAP30不僅步驟繁瑣，而且提取效率低，提取量無法滿足后期研究需要。
　　本研究將傳統(tǒng)中藥學(xué)與現(xiàn)代分子技術(shù)結(jié)合起來，利用基因工程手段去實(shí)現(xiàn)MAP30的異源生產(chǎn)，提高M(jìn)AP30產(chǎn)量，并對異源表達(dá)得到的MAP30進(jìn)行抑菌研究，主要結(jié)果如下：
　?。?）MAP30生物信息學(xué)分析：MAP30分子質(zhì)量約為32.02 kDa，氨基酸殘基數(shù)為286個，理論等電點(diǎn)為9.08，不

3、穩(wěn)定系數(shù)為28.33，在體外哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期為30h，預(yù)測前23位氨基酸MVKCLLLSFLIIAIFIGVPTAKG為信號肽，屬于穩(wěn)定蛋白。
　?。?）MAP30的TA克?。焊鶕?jù)MAP30基因序列設(shè)計出一對特異性引物，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增到與預(yù)期大小相符約900bp的片段，該片段經(jīng)回收與克隆載體pMD18-T相連后導(dǎo)入Escherichia coli DH5α，經(jīng)逐級篩選最終的測序結(jié)果表明，克隆得到的基因序列與GenB

4、ank中已報道的MAP30序列Blast比對，二者一致性高達(dá)99.77％，表明已成功克隆MAP30基因。
　?。?）MAP30原核表達(dá)工程菌的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)：用EcoRⅠ及SalⅠ分別雙酶切pMD18-T-MAP30、pET28a及pET32a三種質(zhì)粒，MAP30基因與表達(dá)載體pET28a及pET32a分別連接，獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-MAP30及pET32a-MAP30分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE)及Rosetta(

5、DE3)pLysS中，最終成功篩選出兩株陽性重組原核表達(dá)工程菌pET32a-MAP30/Rosetta及pET28a-MAP30/BL21；其中，pET28a-MAP30/BL21工程菌在誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示未發(fā)現(xiàn)與理論值大小相一致的目的蛋白條帶，表明該菌株不能成功表達(dá)MAP30；pET32a-MAP30/Rosetta工程菌在誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳及Western blot分析均發(fā)現(xiàn)與理論值大小相一致的目的蛋白條

6、帶，表明該菌株能成功表達(dá)MAP30蛋白；pET32a-MAP30/Rosetta工程菌放大培養(yǎng)后收集上清，并經(jīng)Ni-NTA親和層析得到純化后的MAP30蛋白溶液，最終經(jīng)脫鹽冷凍干燥得到蛋白樣品，發(fā)酵產(chǎn)率能達(dá)242mg/L。
　?。?）MAP30抑菌活性研究：借助牛津杯法得到MAP30融合蛋白的抗菌譜，為革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌，革蘭氏陰性菌的大腸埃希菌及真菌的釀酒酵母；MAP30融合蛋白對金黃色葡萄球菌、大腸埃希