布魯氏菌外膜蛋白Omp15的原核表達及免疫活性鑒定.pdf

1、布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種人畜共患病，給畜牧業(yè)的發(fā)展和人類的健康帶來了很大危害。準確的診斷是有效控制和消滅布魯氏菌病的前提，但目前常用的布魯氏菌病血清學(xué)診斷方法不能區(qū)分是疫苗免疫還是自然感染后引起的血清學(xué)反應(yīng)。研制具有標記性的疫苗或?qū)ふ液线m的布魯氏菌診斷性抗原一直是人們的目標，所以具有免疫原性和抗原保護作用的布魯氏菌外膜蛋白就成了研究的熱點。本試驗從GenBank中下載編碼布魯氏菌外膜蛋白的基因，用BLAST分析后選取與布魯氏菌豬

2、、牛、羊這三種生物型基因序列的同源性高又與其他革蘭氏陰性細菌沒有交叉反應(yīng)的基因，同時對目的基因編碼的蛋白質(zhì)用TMHMM和ConPredⅡ軟件進行信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)的分析后，選取沒有跨膜結(jié)構(gòu)且全部在膜外的蛋白進行研究。本試驗依據(jù)以上條件選取了羊布魯氏菌16M預(yù)測的分泌性蛋白質(zhì)Omp15對其進行初步研究。 本試驗采用降落PCR方法，以滅活的羊布魯氏菌16M的基因組為模板，擴增出大約423bp的基因片段，將目的基因片段用限制性內(nèi)切酶Ba

3、mHI、EcoR I雙酶切后直接與同樣雙酶切的表達載體pGEX-4T-2連接，將該片段克隆于原核表達載體pGEX-4T-2中，之后將重組表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21。經(jīng)重組載體的菌液:PCR鑒定、重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定和測序鑒定:證明成功擴增出了目的基因，并且將其成功重組到了表達載體pGEX-4T-2中。重組菌在0.5 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)后5h目的蛋白質(zhì)表達量達到了高峰。表達融合蛋白質(zhì)分子量約為41kDa，以包涵體形式存在

4、。以不同濃度尿素洗滌包涵體，然后用8M尿素溶解，電洗脫方法純化融合蛋白質(zhì)。用western-blotting分析重組表達的融合蛋白質(zhì)Ompl5的反應(yīng)原性，發(fā)現(xiàn)該蛋白能與豚鼠的布魯氏菌陽性血清發(fā)生較強烈反應(yīng)。進而用電洗脫方法純化了該蛋白質(zhì)，并將其作為抗原包被，用豚鼠的布魯氏菌陽性血清為一抗，兔抗豚鼠IgG為二抗，進行ELISA檢測，進一步探索獲得的蛋白質(zhì)作為診斷蛋白的可能性。 本試驗成功構(gòu)建了pGEX-4T-2/Ompl5重組載體