重組鈣網(wǎng)蛋白150-230片段的原核表達、純化及免疫學功能研究.pdf

1、鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+結合蛋白，其可以作為分子伴侶，幫助新生多肽鏈進行正確折疊，以及參與 MHCⅠ類分子/抗原肽復合物的形成等過程。CRT全長416個氨基酸，由N-domain，P-domain，C-domain三個結構域組成。N-domain是一個凝集素樣的球形結構域，能夠與具有特定結構的多糖結合。P-domain和C-domain可以結合Ca2+，對維持細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)具有重要作用。CRT

2、的N端的信號肽以及C末端的KDEL序列，使其能夠?qū)虿Ⅰv留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。但近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，CRT還能夠在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外發(fā)揮重要的免疫生物學功能。CRT能夠以膜形型式出現(xiàn)在細胞表面，參與凋亡細胞清除以及抗腫瘤免疫應答。CRT還能夠以可溶性的形式出現(xiàn)在自身免疫病患者的血清以及關節(jié)液等體液中，提示其可能參與自身免疫應答過程。
　　我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，重組表達的小鼠CRT片段39-272（recombinant CRT/39-272，r

3、CRT/39-272）具有較強的免疫生物學活性，能夠直接激活小鼠腹腔巨噬細胞以及B細胞。rCRT/39-272具有很強的免疫原性，免疫小鼠能夠誘導特異性抗體的產(chǎn)生。rCRT/39-272還具有免疫佐劑效應，用融合表達的rCRT-EGFP蛋白免疫小鼠能夠誘導產(chǎn)生增強的針對EGFP的體液免疫應答。rCRT/39-272與rCRT全長蛋白相比，兩者對小鼠腹腔巨噬細胞和B細胞的免疫刺激活性相似，提示CRT/39-272是CRT的主要功能活性片段

4、。在此研究的基礎上，本課題對rCRT發(fā)揮免疫學活性的更小功能片段進行了深入研究。
　　我們利用分子生物學方法對CRT/39-272片段進一步縮小，分別構建了攜帶不同CRT片段的原核表達載體，并且利用大腸桿菌系統(tǒng)中進行了原核表達與親和純化。結果顯示，rCRT/150-230是保留CRT的免疫生物學活性的最小功能片段。rCRT/150-230具有良好的可溶性，能夠在溶液中以多聚體的形式存在。rCRT/150-230能夠有效激活小鼠腹腔