可溶性重組人精囊蛋白1片段的原核表達及其對精子活力的影響.pdf

1、近年來，國內外針對男性避孕疫苗的研究取得了突出的進展，主要集中于:(1)幾種非常有潛能的重要蛋白被發(fā)現(xiàn)，包括Eppin，F(xiàn)SHR，Izumo，CRISP-1，CatSper1等;(2)佐劑及免疫誘導等方面更成熟。這些為研制高效、可逆性避孕疫苗提供了重要的前提條件。然而，由于天然自身抗原的抗原性弱，且缺乏蛋白質晶體結構的解析，嚴重制約了對其關鍵功能域的改造研究，迄今仍無理想的避孕疫苗問世。
　　人精囊蛋白屬于快速進化類蛋白，在人體多

2、個組織中都有表達，包括腫瘤組織。人精囊蛋白可以分為兩種類型，即精囊蛋白Ⅰ(semenogelinⅠ，SEMG1)和精囊蛋白Ⅱ(semenogelinⅡ，SEMG2)。在射精時，精囊蛋白與精液混合，形成精液凝膠，抑制精子向前運動。目前的研究表明:在機體內，金屬離子與蛋白質的結合對控制諸如記憶、學習等生理過程發(fā)揮重要的調節(jié)作用，精囊蛋白亦是如此。鋅離子與精囊蛋白結合后，通過改變蛋白的三級結構，從而控制精囊蛋白相關作用的發(fā)揮。除此以外，精子細

3、胞膜表面的鈣離子泵，目前認為與精子活力的變化息息相關。
　　精囊蛋白必須通過與精子尾部表面Eppin蛋白相結合，再與叢生蛋白、乳鐵蛋白形成一種稱為EPC的復合物，從而發(fā)揮其生物學活性。將重組Eppin蛋白主動免疫雄性猿猴后，可以檢測到特異性抗Eppin抗體，且免疫后78％雄性不育?？笶ppin抗體的結構與SEMG結構非常相似。因此，本研究認為，通過研究SEMG1蛋白結構及其與Eppin相互作用位點，可能為新型免疫避孕疫苗的研究提供

4、依據(jù)。本課題計劃通過原核表達足量可溶性重組蛋白，為下一階段蛋白質結晶與晶體結構解析做準備，進而為候選疫苗研究提供條件。
　　本課題分為以下三個部分:第一部分:SEMG1與△SEMG1蛋白質氨基酸序列分析，運用計算機軟件對蛋白氨基酸序列及二級結構進行分析、比較;第二部分:構建△SEMG1可溶性蛋白質的原核表達體系，探尋重組蛋白最佳表達載體，大量表達的最優(yōu)誘導條件以及純化方式等;第三部分:純化后的重組蛋白的功能驗證。
　　結果:

5、1、△SEMG1蛋白質二級結構中共有5個α-螺旋，4個β-折疊片，且分布不規(guī)則;△SEMG1蛋白片段具有較強的抗原性與親水性;△SEMG1結構分析表明相對SEMG1更適合用于重組目的蛋白表達;2、從多種原核表達載體及工程菌中（包括帶有sumo標簽質粒、pet-28b質粒、ROSETTA等）中經優(yōu)化改良，最終獲得可溶性重組蛋白;3、經反復嘗試，最終獲得了結合Amylose層析柱、TEV酶過夜酶切、目的蛋白Ni柱純化以及分子篩純化相結合的純

6、化方式，并獲得高純度、可溶性目的蛋白;4、純化后的△SEMG1重組蛋白經Western blot驗證為與理論分子量大小一致的蛋白質，且經質譜分析證實為△SEMG1;5、純化后的△SEMG1重組蛋白對精子活力有明顯的抑制效應。
　　綜上所述，本研究通過分析SEMG1蛋白質氨基酸序列及其二級結構特點，確定其165～281aa，即△SEMG1為研究目標;在pMal-c2x-TEV載體上成功地插入△SEMG1基因片段，構建了可表達可溶性△