豬流行性腹瀉病毒重組M蛋白的原核表達(dá)、純化及鑒定.pdf

1、M蛋白是豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的主要的結(jié)構(gòu)蛋白，與Genbank上的其它毒株相比較發(fā)現(xiàn)M基因具有很高的保守性，所以重組M蛋白可作為理想的檢測(cè)抗原用于臨床PEDV感染的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)為使M蛋白在原核細(xì)胞中得以表達(dá)，對(duì)M基因設(shè)計(jì)了幾個(gè)大小不同的片斷，同時(shí)采用不同的載體系統(tǒng)，探索了M基因的表達(dá)效果，即將豬流行性腹瀉病毒的M基因及編碼M蛋白膜外區(qū)M基因片斷(M')分別亞克隆到原核表達(dá)載體pJLA605和pGEX-6p-1中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒p

2、JLA605-M、pGEX-6p-M-GST、pGEX-6p-M和pGEX-6p-M'，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，探索了M蛋白在N端和C端不帶有谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)、N端和C端均帶有GST、只在N端帶有GST以及只含有M蛋白的膜外區(qū)M'蛋白的表達(dá)情況。SDS-PAGE分析結(jié)果表明，N端和C端帶有GST的pGEX-6p-M-GST和只含有膜外區(qū)M'基因的重組質(zhì)粒pGEX-6p-M'獲得了高效表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物分別以融合蛋白GST-M和GST-

3、M'形式存在，經(jīng)AlpharImager2200軟件分析，表達(dá)量分別為20％和45％。對(duì)重組融合的M'蛋白進(jìn)行包涵體提取及凝膠過濾層析純化，得到純度達(dá)90％以上的重組蛋白。分別用抗CV777株P(guān)EDVM蛋白的單克隆抗體和純化PEDV病毒粒子對(duì)重組M'蛋白及由其制備的多克隆抗血清進(jìn)行了鑒定，Westernblotting及ELISA檢測(cè)結(jié)果均表明重組M'蛋白有很好免疫原性與反應(yīng)原性，因此重組M'蛋白與天然PEDVM蛋白有相同的生物學(xué)活性。