豬流行性腹瀉病毒膜蛋白和核蛋白抗原表位的鑒定.pdf_第1頁(yè)
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1、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文豬流行性腹瀉病毒膜蛋白和核蛋白抗原表位的鑒定姓名：張志榜申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：馮力201106AbstractPorcineepidemicdiarrhea(PED)isallentericdiseaseofswinemainlycharacterizedbyenteritis，diarrheavomitingandevendehydrationThepathogenofPEDisporc

2、ineepidemicdiarrheavirus(PEDV)TheprevalenceofPEDallovertheworldhasresultedsevereeconomiclossestotheswineindustryInthepresentstudyMembrane∽proteingeneandNucleocapsid(N)proteingeneofPEDVCH／SHH／06sUainwereamplifiedbyreverse

3、transcriptionpolymerasechainreaction(RTPCR)TheamplifiedgeneswereclonedintothepGEMTvectorforsequencingrespectivelyARervalidationofthecorrectionoftheinsertedgenes，thetruncatedMgenem嗚295bp678bp)wasamplifiedbypolymerasechain

4、reaction0“CR)withtheverifiedplasmidtK；EMTMastemplateandthetMgeneWaSinsertedintotheprokaryoticexpressionplasmidspET030aandpGEX6Pd，respectivelyAfterdigestionofNproteingenefromverifiedplasmidI’GEMTNbyrestrictionenzymes，Ngen

5、ewasinsertedintotheprol泣ryoticexpressionvectorpET30atogeneraterecombinantplasmidpET30aNRecombinantproteinstMHis6andGSTtMandNHis6wereexpressedbyinducingpET30atMtransformedEcoliand田EX_6P1m訂transformedEcoliandpET30aNtransfo

6、rmedEcoliwithIFrGEcoliSlainStransformedbypET30aandpGEX6P1wereoperatedinparallelasnegativecontrolsThemolecularweithtoftherecombinantproteinswere15Ku(tMHis0，40Ku(GSTtM)and49Ku(NHisOrespectivelyshownbySDS—PAGEanalysisAnditw

7、asrevealedbyWesternblotassaysthatalltherecombinantproteinscouldreactwithrabbitantiPEDVserumspecificallyindicatingthattherecombinantproteinshavegoodreactivityToprepareMAbsagainstMandNproteinofPEDVBALB／cmicewereimmunized、析

8、tllpurifiedrecombinantproteinstMHis6orNHis6OneStr0IiIlofhybridomasecretingantibodiesagainstMproteinandthreehybfidomasagainstNproteindesignedasD4，4G1，4H7and2G3，respectivelywereobtainedTheMAbD4WasIgGlsubtypewithcchainandal

9、lofthethreeMAbsofNproteinwereIgG2bsubtypewith1cchairVeroE6cellsinfectedwitllPEDVshowedimmunofluorescencewiththeMAbsD4，4G1or4H7asprimaryantibodyprovedbyIndirectimmunofluorescenceassay(IFA)MAbD4couldreactwithauthenticMprot

10、einrevealedbyWesternblotanalysisThroughaseriesofexpressionofmmcatedMproteinsandNproteins，theantigenicepitopeagainstMAbsD4，4GI，4H7and2G3werepreliminaryestablishedwhichwere193TGWA嗍200，“t慚MRRGERIEQPS7l竹，“143ERDI，KD刪jwRRmKGl

11、53’’and337aa～396aa“ofNproteinrespectivelyInordertofinelyidentifytheantigenicepitopesofPEDVMproteinandNproteintheterminalaminoacidresiduesb0Ⅱlfromcarboxyandaminoterminalsoftheepitopesweredeletedonebyonetodeterminethecorea

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